低pH液复灌对兔心肌缺血再灌注的保护作用与Bcl-2、Bax表达的关系

目的探讨低pH液复灌对体外循环(extracorporeal circulation,ECC)下兔缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)心肌的保护作用与Bcl-2、Bax表达的关系。方法成年新西兰大白兔30只,完全随机分为5组(n=6):对照组(C组)不停跳,体外循环180 min;缺血再灌注组(I/R组)全心缺血40 min,再灌注120 min;pH=7.4组与pH=6.9组于再灌注前2 min予37℃的95%O2+5%CO2饱和的pH值为7.4或6.9的K-H液灌注;缺血后处理组(P组)再灌注的前2 min给予缺血后处理。体外循环结束后,光镜观察心肌形态学变化;ELISA测定血清肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)浓度;RT-PCR检测Bcl-2、Bax mRNA的表达;免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果与I/R组比较,pH=6.9组和P组心肌组织损伤较轻,cTnI浓度较低(P<0.05),pH=6.9组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显增高[(1.058 1±0.165 7)vs(0.648 2±0.070 8),(0.233 1±0.022 5)vs(0.156 5±0.019 2),P<0.05],Bax mRNA和蛋白表达水平明显降低[(1.353 3±0.138 1)vs(1.901 7±0.198 1),(0.173 5±0.015 1)vs(0.247 1±0.021 3),P<0.05];pH=6.9组和P组之间Bcl-2、Bax表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论体外循环下再灌注初短暂低pH(pH=6.9)液复灌可以模拟缺血后处理的心肌保护作用,其保护机制与调节Bcl-2、Bax的表达有关。

JAK/STAT通路在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)通路在大鼠肾脏缺血再灌注损伤(I/R)中的作用。方法将36只SD大鼠随机分为对照组I、/R组、Ag490(JAK2激酶抑制剂)组(n=12)。I/R组和Ag490组大鼠夹闭双侧肾动脉60min,恢复再灌注24h,对照组大鼠除不钳夹双侧肾蒂外,余步骤与I/R组、Ag490组相同。Ag490组大鼠术前1h以8mg/kg Ag490灌胃,对照组和I/R组给予等量生理盐水灌胃。HE染色观察肾组织的病理改变,免疫组化方法检测肾组织中STAT 3、Bcl-2蛋白表达,TUNEL法检测细胞凋亡水平。结果组织学检查发现对照组肾小管排列整齐,间质无充血水肿;I/R组可见部分肾小管上皮细胞肿胀,空泡变性,肾小管扩张,可见管型和坏死脱落细胞,间质充血水肿,大量炎细胞浸润;Ag490组组织损伤较I/R组加重。免疫组化结果显示,I/R组STAT 3、Bcl-2蛋白表达较对照组明显增多,细胞凋亡增加(P<0.05);Ag490组STAT 3、Bcl-2的蛋白水平较I/R组明显降低,细胞凋亡加重(P<0.05)。结论 I/R可通过JAK2途径诱导STAT 3激活,上调Bcl-2蛋白表达;阻断JAK2激活可抑制STAT 3表达,下调Bcl-2蛋白表达,加重细胞凋亡。

长程服用苯巴比妥和托吡酯对幼鼠脑组织中Bcl-2和Bax蛋白的影响

目的探讨长程服用苯巴比妥(PB)和托吡酯(TPM)对幼鼠脑组织中Bcl-2和Bax蛋白的影响。方法将60只日龄18 d的健康SD幼鼠随机分为正常对照组、PB组、TPM组,各20只。根据给药时程又将每个给药组分为2周短程及4周长程给药组,共6组,各10只。PB组给予PB 30 mg·kg-1·d-1灌胃,TPM组给予TPM 40 mg·kg-1·d-1灌胃,正常对照组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。3组分别于2周、4周时测幼鼠体质量后采血并处死,称取脑质量,脑组织石蜡包埋,切片,进行苏木素-伊红染色及尼氏染色,光镜下观察脑组织形态变化。用免疫组化方法检测各组大鼠脑切片海马及额叶皮质凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。结果短程PB给药组和短程TPM给药组体质量、脑质量及脑组织结构变化与正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。长程PB给药组幼鼠脑质量较正常对照组明显减轻(P<0.01),额叶皮质神经元减少,且神经元结构明显异常。长程TPM给药组体质量、脑质量及脑组织结构变化与正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。长程PB给药组幼鼠脑组织额叶皮质Bax蛋白表达水平高于正常对照组(P<0.01),Bax/Bcl-2比值高于正常对照组(P<0.05)。长程TPM给药组幼鼠脑组织Bax蛋白水平及Bax/Bcl-2比值与正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论长程服用PB可引起发育中脑组织明显的组织学损伤及神经元坏死与过度凋亡,幼鼠脑组织额叶皮质Bax蛋白表达显著增强和Bax/Bcl-2比值增高可能是未成熟鼠脑质量减轻和引起脑功能障碍重要原因。长程服用TPM后幼鼠脑组织结构无明显变化。

微小RNA⁃204⁃3p通过靶向调控Krüppel样因子6对高糖诱导小鼠足细胞损伤的保护作用

目的探讨微小RNA⁃204⁃3p(miR⁃204⁃3p)对高糖诱导小鼠足细胞MPC5损伤的保护作用及其分子机制。方法采用高糖(30 mmol/L D⁃葡萄糖)处理MPC5细胞。实时定量PCR(qPCR)检测细胞中miR⁃204⁃3p与锌指蛋白Krüppel样因子6(KLF6)mRNA水平。MPC5细胞分为NG组(正常对照),HG组(高糖刺激),HG+miR⁃204⁃3p组、HG+miR⁃NC组、HG+si⁃KLF6组、HG+si⁃NC组,HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA⁃KLF6组和HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA组。蛋白质印迹法(Western Blot)检测肌动蛋白微丝偶联蛋白(synaptopodin)、结蛋白(desmin)、B细胞淋巴瘤/白血病⁃2(Bcl⁃2)、Bcl⁃2相关X蛋白(Bax)与活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved⁃caspase⁃3)蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡,生物学信息预测和双荧光素酶报告基因分析miR⁃204⁃3p和KLF6的靶向关系。结果与正常对照相比,高糖可显著降低MPC5细胞中miR⁃204⁃3p表达量[(0.41±0.04)比(1.02±0.08)],上调KLF6 mRNA[(2.86±0.27)比(1.03±0.08)]和蛋白[(0.89±0.08)比(0.46±0.04)]水平,还可上调KLF6、desmin[(0.81±0.07)比(0.34±0.03)]、Bax、cleaved⁃caspase⁃3蛋白表达及细胞凋亡率[(22.46±2.08)%比(5.26±0.64)%],下调synaptopodin蛋白[(0.34±0.03)比(0.76±0.07)]及Bcl⁃2蛋白表达量(P<0.05)。与HG+miR⁃NC组比较,HG+miR⁃204⁃3p组明显提高synaptopodin[(0.67±0.06)比(0.32±0.03)]及Bcl⁃2蛋白水平,降低desmin[(0.41±0.04)比(0.83±0.08)]、Bax、cleaved⁃caspase⁃3蛋白水平及细胞凋亡率[(11.25±1.65)%比(24.58±2.47)%](P<0.05)。与HG+si⁃NC组比较,HG+si⁃KLF6组明显提高synaptopodin[(0.62±0.06)比(0.28±0.03)]及Bcl⁃2蛋白水平,降低desmin[(0.49±0.05)比(0.86±0.08)]、Bax蛋白水平及细胞凋亡率[(14.69±1.87)%比(25.47±2.68)%](P<0.05)。miR⁃204⁃3p直接靶向KLF6。与HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA组比较,HG+miR⁃204⁃3p+pcDNA⁃KLF6组显著增加高糖刺激小鼠肾脏足MPC5细胞中KLF6、desmin[(0.68±0.06)比(0.36±0.04)]、Bax蛋白表达量和细胞凋亡率[(18.41±1.67)%比(11.05±1.02)%],显著减少synaptopodin蛋白[(0.38±0.03)比(0.69±0.07)]和Bcl⁃2蛋白表达量(P<0.05)。结论miR⁃204⁃3p通过直接靶向KLF6抑制高糖刺激的足细胞凋亡,保护细胞损伤。

DEAD⁃box解螺旋酶46基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的分析短发夹RNA(shRNA)介导DEAD⁃box解螺旋酶46(DDX46)基因沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量逆转录PCR(RT⁃qPCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)测定人正常乳腺上皮细胞系和乳腺癌细胞系中DDX46表达差异。以慢病毒介导的shRNA敲低乳腺癌SK⁃BR⁃3细胞中DDX46的表达,实验分为空白对照组、阴性对照组和sh⁃DDX46组。RT⁃qPCR检测各组细胞DDX46 mRNA的表达水平,蛋白质印迹法检测DDX46蛋白和凋亡相关蛋白的表达水平,克隆形成和四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果DDX46 mRNA在各乳腺癌细胞系中的表达量均高于正常乳腺上皮细胞(P<0.05)。sh⁃DDX46组细胞DDX46 mRAN和蛋白表达水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。sh⁃DDX46组的细胞生长增殖能力明显低于两对照组(P<0.05)。空白对照组、阴性对照组和sh⁃DDX46组SK⁃BR⁃3细胞凋亡率分别为(4.21±1.65)%、(5.36±1.23)%和(10.21±2.39)%,与空白对照组和阴性对照组相比,sh⁃DDX46组SK⁃BR⁃3细胞凋亡率明显增加(P=0.007;P=0.016)。沉默DDX46后凋亡通路蛋白B细胞淋巴瘤/白血病⁃2(Bcl⁃2)的表达量明显降低(P<0.05),Bcl⁃2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶⁃3剪切体(cleaved Caspase⁃3)表达明显增高(P<0.05)。结论DDX46在乳腺癌细胞中高表达,沉默DDX46基因能够抑制乳腺癌细胞增殖并促进凋亡,凋亡信号通路可能是其作用机制之一。

不同时期浅低温对大鼠脑缺血再灌注时谷氨酸、Bel—2和Bax水平的影响

目的评价不同时期低温对大鼠脑缺血再灌注时脑组织谷氨酸、Bcl-2和Bax水平的影响。方法成年雄性sD大鼠24只，随机分为4组（n=6），A组、B组、C组和D组均采用四血管阻断20min的方法制备全脑缺血再灌注模型。B组、C组和D组均采用鼻咽腔降温的方法维持海马温度32．5～33．5℃1h，B组降温结束时进行缺血；C组缺血的同时开始降温；D组再灌注的同时开始降温，3组降温结束后开始复温。缺血和再灌注100min期间每隔10min收集一次海马CAl区微透析液，测定谷氨酸浓度，反映海马CA1区谷氨酸释放水平。再灌注3h时，取脑组织，测定海马CA1区Bcl-2和Bax的表达水平，并计算Bcl-2和Bax表达的比值（Bcl-2／Bax）。结果与A组比较，其他3组再灌注期间海马谷氨酸释放水平降低，Bcl-2表达上调，Bax表达下调，Bcl，2／Bax升高（P〈0．05）；与B组比较，C组海马Bcl-2表达下调，Bax表达上调，Bcl-2／Bax比值降低（P〈0．05）；与C组比较，D组再灌注期间海马谷氨酸释放水平升高，Bax表达上调，Bcl-2／Bax降低（P〈0．05）。结论降温实施越早减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的效应越强。