bcl-2小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

为了探讨以bcl2基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,构建bcl2基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL60/VCR细胞,在G418筛选后应用Westernblot进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;Westernblot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bax和耐药相关蛋白ZNRD1的表达变化。结果表明:成功构建了bcl2的小干扰RNA载体并转染HL60/VCR;经蛋白质水平检测证实成功建立了bcl2低表达的白血病细胞模型;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达耐药相关蛋白ZNRD1。结论:bcl2小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性。

肝癌组织Bcl-2的检测及小干扰RNA抑制

目的探究肝癌组织中Bcl-2的表达与肝癌临床病理特征、患者预后之间的关系;观察siRNA抑制Bcl-2表达后,SMMC-7721增殖能力的变化。方法通过反转录PCR、免疫组织化学SP法以及Western blot法检测68例肝癌组织中Bcl-2的表达;根据Bcl-2表达水平的高低进行分组,比较不同组中肝癌临床病理特征及患者预后;通过siRNA抑制Bcl-2在SMMC-7721细胞中的表达,应用MTT法检测细胞增殖能力的变化。结果相较于癌旁组织,Bcl-2肝癌中表达明显升高;Bcl-2在肝癌组织中表达水平与肝癌临床病理特征存在明显相关性,Bcl-2表达水平较高的患者预后较差;siRNA抑制SMMC-7721细胞中Bcl-2的表达后细胞增殖能力显著降低。结论 Bcl-2的表达在肝癌组织中异常增高,且与肝癌临床病例特征及患者预后存在相关性;抑制Bcl-2的表达可降低肝癌细胞的增殖能力。

RNA干扰Bcl-2基因表达对人胆囊癌细胞株GBC-SD裸鼠移植瘤生长的影响

目的探讨RNA干扰Bcl-2基因表达对人胆囊癌细胞GBC-SD裸鼠体内成瘤能力和移植瘤生长的影响。方法本课题分为成瘤能力和治疗两个方面。成瘤能力:用针对Bcl-2基因小干扰RNA(siRNA)真核表达载体稳定转染的人胆囊癌细胞GBC-SD和人胆囊癌细胞GBC-SD分别制作裸鼠模型,观察移植瘤的生长情况,计算肿瘤成瘤率、生长体积、生长率。治疗实验:制作人胆囊癌细胞GBC-SD移植瘤模型,随机分为pSilencerTM-EGFPsh515组(实验组)、pSilencerTM-EGFPshCon组(空载体阴性对照组)和正常对照组。实验组用Bcl-2基因的siRNA真核表达载体多点注射于移植瘤周围,空载体阴性对照组用空载体多点注射于移植瘤周围,正常对照组不作处理,观察移植瘤的生长情况,计算肿瘤生长体积、生长率。6周后处死裸鼠,剥离瘤体组织进行称重,并采用免疫组化检测Bcl-2蛋白的表达。结果①成功地建立裸鼠人胆囊癌GBC-SD细胞的动物模型;②成瘤能力:人胆囊癌细胞GBC-SD组和Bcl-2siRNA稳定转染细胞组成瘤率分别为100%、60%,瘤体平均体积分别为(1914.6±125.0)mm3、(629.7±78.9)mm3,平均生长率分别为45.58%、14.99%,瘤体重量分别为(2.24±0.33)g、(0.77±0.12)g,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05);③治疗实验:实验组、空载体阴性对照组及正常对照组瘤体平均体积分别为(729.7±66.6)mm3、(1493.2±98.9)mm3、(1548.67±101.0)mm3,瘤体平均重量分别为(0.82±0.10)g、(1.68±0.21)g、(1.90±0.25)g,平均生长率分别为18.711%、38.286%、39.709%。实验组与空载体阴性对照组及正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),而空载体阴性对照组与正常对照组比较无明显差异。结论针对Bcl-2基因siRNA真核表达载体转染人胆囊癌GBC-SD细胞可以有效降低Bcl-2基因的表达,该基因沉默后肿瘤细胞增殖受到抑制,体内成瘤能力下降,瘤体生长减慢。

RNA干扰bcl-2基因对人骨肉瘤细胞株MG63增殖影响的实验研究

目的探讨RNA干扰bcl-2基因对人骨肉瘤细胞体外增殖及凋亡的调控作用。方法选用人骨肉瘤细胞进行体外培养，以siRNA分别处理MG63细胞24～72h后，MTT法检测细胞增殖，SABC免疫组织化学法检测细胞内bcl-2、bcl-xl、bax、caspase-3和C-myc蛋白表达水平。结果RNA干扰bcl-2基因对MG63细胞增殖有抑制作用。下调bcl-2的表达的同时，上调了caspase-3蛋白表达水平，并使C-myc蛋白表达水平下调。对bcl-xl、bax的蛋白表达无明显影响。结论RNA干扰显著降低bcl-2蛋白的表达，对人骨肉瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用。

RNA干扰bcl-2基因对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖影响的实验研究

目的探讨RNA干扰bcl-2基因对人卵巢癌细胞体外增殖及凋亡的调控作用.方法选用人卵巢癌细胞进行体外培养,以siRNA分别处理SKOV3细胞24～72h后,MTT法检测细胞增殖,SABC免疫组织化学法检测细胞内bcl-2、bcl-xl、bax、caspase-3蛋白表达水平.结果 RNA干扰bcl-2基因对SKOV3细胞增殖有抑制作用.bcl-2表达下调,Caspase-3蛋白表达水平上调.结论 RNA干扰bcl-2对人卵巢癌细胞的增殖具有明显的抑制作用.下调bcl-2的表达,上调Caspase-3蛋白表达水平.特异性地降解抗凋亡基因bcl-2的mRNA是其作用机制.

RNA干扰VEGF-C基因下调COX-2、Bcl-2表达对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的利用人血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)小RNA干扰(siRNA)表达载体——重组质粒pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA,研究VEGF-C基因下调抑制COX-2、Bcl-2表达及对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435的体外作用。方法pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA表达质粒和阴性对照质粒稳定转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-435,RT-PCR和Western blot检测转染前后VEGF-C、COX-2基因和VEGF-C、COX-2、Bcl-2蛋白的表达;MTT法和流式细胞仪检测VEGF-CRNA干扰对细胞的作用。结果pSilencer3.0-VEGF-C/siRNA转染乳腺癌细胞MDA-MB-435,VEGF-C基因和蛋白水平表达量明显降低,COX-2和Bcl-2表达下调,细胞体外活性下降,72h后凋亡率达60%。结论针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体抑制VEGF-C表达的同时下调COX-2和Bcl-2的表达,促进乳腺癌细胞MDA-MB-435的凋亡。

RNA干扰对兔血管平滑肌细胞bcl-2基因表达的影响

目的研究RNA干扰(RNAi)对兔血管平滑肌细胞(VSMCs)bcl-2基因表达的干扰效应。方法用脂质体法将构建的装载靶向bcl-2基因小干扰性RNA(siRNA)的表达载体(pshRNA-bcl-2质粒)转染VSMCs(基因组),以转染空载体的细胞和加DMEM的空白细胞作为对照,采用半定量RT-PCR和Westernblot法检测bcl-2基因的表达,用MTT法检测VSMCs生长情况。结果转染siRNA的表达载体可以抑制内源性bcl-2基因在转录和转译水平上的表达,基因组bcl-2的mRNA和蛋白表达较空载体组和空白对照组明显减少(P<0.01);基因组的VSMCs生长也较空载体组和空白对照组明显受到抑制(P<0.01)。结论载体介导的RNAi技术可明显抑制内源性bcl-2基因的表达和VSMCs生长。

靶向bcl-2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立

目的构建针对bcl-2基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体,转染到bcl-2基因高表达的胃癌细胞株SGC-7901中,并筛选出稳定低表达bcl-2基因的细胞株。方法针对bcl-2基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列,插入质粒载体pGPH1/GFP/Neo中,经脂质体介导转染SGC-7901细胞。RT-PCR检测bcl-2基因在mRNA水平的变化,MTT法检测bcl-2基因沉默后胃癌SGC-7901细胞的增殖情况。基因沉默效果最好的一组,经G418筛选以得到稳定表达株。结果与对照组相比,转染成功后的细胞bcl-2基因在mRNA水平均显著下降,细胞增殖速度明显降低(t=2.41,P<0.05);并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆。结论本研究成功利用针对bcl-2基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl-2基因的SGC-7901细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础。

靶向BIRC5,Bcl-2siRNA慢病毒表达载体最佳干扰序列的筛选

目的 针对设计合成构建的BIRC5和Bcl-2小分子干扰RNA（siRNA）的慢病毒质粒表达载体进行有效靶序列筛选,探讨其对靶基因的封闭和抑制作用.方法 将BIRC5和Bcl-2 siRNA慢病毒质粒表达载体通过脂质体介导,分别转染体外培养的Tca-8113细胞.采用半定量RT-PCR检测转染细胞BIRC5和Bcl-2 mRNA表达及Western blot检测蛋白表达水平.结果 BIRC5和Bcl-2 mRNA抑制率分别为35%～76%和30%～72%,所设计的siRNA序列不同程度降低和下调其mRNA及相应的蛋白表达,实验组与对照组比较差异有统计学显著性意义（P〈0.05）,阴性对照组无此作用（P〉0.05）.结论 设计合成的siRNA干扰序列能抑制其靶基因mRNA和蛋白的表达,不同的干扰靶点其抑制效果不同,本实验成功筛选出两对最佳干扰序列作为对肿瘤细胞基因治疗的实验研究.

bcl-2 shRNA表达载体的构建及其在K562细胞中的干扰作用研究

目的构建bcl-2shRNA表达载体,观察其在人白血病K562细胞系中对bcl-2基因的干扰作用。方法设计合成有短发夹结构靶位bcl-2基因的65个碱基的寡核苷酸,连接到载体pSIREN-Shuttle(pSS),构建了bcl-2shRNA表达载体,得到重组质粒pSS-shbcl-2-1、pSS-shbcl-2-2、pSS-shbcl-2-3和一个阴性对照,将其稳定转染K562细胞,分别用RT-PCR、Western-blot法检测转染后K562细胞bcl-2 mRNA及蛋白质表达水平。结果成功构建了bcl-2shRNA的表达载体,并筛选到转染后K562细胞在pSS-shbcl-2-3组bcl-2基因的mRNA和蛋白质表达水平明显抑制。结论特异性的bcl-2shRNA可以干扰K562细胞中bcl-2基因的表达,针对bcl-2基因不同位点的不同shRNA也有干扰效果的差异。

Bcl-2基因RNA干扰对体外培养的鹅卵泡颗粒细胞凋亡、增殖和孕激素分泌的影响

根据已发表的Bcl-2基因序列设计3对siRNA（Small interference RNA）序列，构建干扰表达载体，转染体外培养的鹅卵泡颗粒细胞，48h后利用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）检测颗粒细胞Bcl-2蛋白表达量、凋亡和增殖情况，收集细胞培养液用放射免疫分析法检测孕激素（P）的分泌水平；此外，还检测了F1～F4卵泡、最小的排卵前卵泡（The smallest preovulatory follicle，SPF）、小黄卵泡（Small yellow follicle，SYF）和闭锁卵泡（Atresic follicle）颗粒细胞Bcl-2蛋白表达和凋亡情况。结果表明：（1）各级卵泡颗粒细胞Bcl-2蛋白的表达存在着差异，正常卵泡颗粒细胞Bcl-2蛋白表达量显著高于闭锁卵泡（P〈0．05），SPF颗粒细胞Bcl-2蛋白表达水平显著高于SYF（P〈0．05）；（2）干扰组Bcl-2蛋白表达水平显著低于所有对照组（P〈0．05），而细胞凋亡指数（Apoptosis index，AI）、增殖指数（Proliferation index，PI）和P分泌水平均高于对照组。

RNA干扰对肝癌细胞增殖及其Bcl-2表达的影响

目的观察靶向Bcl-2基因的shRNA对肝癌HepG-2细胞增殖及其Bcl-2表达的影响。方法构建靶向Bcl-2基因的shRNA,转染对数生长期HepG-2细胞,设空白组、空载体组、pGenesil-B1组、pGenesil-B2组、pGenesil-B3组、pGenesil-S组;MTT法检测HepG-2细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测HepG-2细胞凋亡率,RT-PCR法检测Bcl-2 mRNA,免疫细胞化学SP法检测Bcl-2蛋白。结果空白组、空载体组、pGenesil-B1组、pGenesil-B2组、pGene-sil-B3组、pGenesil-S组细胞抑制率分别为0、4.6%、3.8%、46.4%、8.3%、0.13%,细胞凋亡率分别为33.95%、48.80%、69.14%、90.50%、58.14%、50.96%,Bcl-2 mRNA的表达抑制率分别为0、3%、8.3%、49.1%、4.8%、1.8%,Bcl-2蛋白阳性率分别为38.15%±3.46%、35.25%±2.67%、15.21%±2.32%、9.51%±2.51%、14.15%±2.67%、36.83%±3.35%,pGenesil-B2组与其他各组相比,P均<0.01。结论shRNA可致HepG-2细胞凋亡,并抑制Bcl-2的表达。

RNA干扰介导Bcl-2下调促进ZR75-1和MCF-7乳腺癌细胞凋亡

目的构建高效稳定的Bcl-2基因的RNA干扰慢病毒载体,检测Bcl-2的表达对细胞凋亡的影响。方法构建人Bcl-2慢病毒短发夹RNA(shRNA)干扰载体Lenti-H1 shRNA,转染HEK293T细胞,通过实时定量PCR及Western blot法检测Lenti-H1 shRNA的干扰效果。Lenti-H1 shRNA与4个包装质粒共同转染HEK293T细胞,包装成慢病毒后,分别感染ZR75-1和MCF-7乳腺癌细胞;嘌呤霉素筛选2周,收集细胞进行Western blot法检测Bcl-2蛋白的水平;采用流式细胞术检测乳腺癌细胞的凋亡情况。结果构建的Lenti-H1 Bcl-2 shRNA能够有效抑制Bcl-2蛋白的表达;流式细胞术结果显示,Bcl-2表达下调后明显促进细胞凋亡。结论慢病毒介导的Bcl-2蛋白下调能促进乳腺癌细胞的凋亡。

RNA干扰抑制结肠癌细胞内Bcl-2／C-Raf的表达

[目的]构建Bcl-2/C-Raf的双靶点的RNAi质粒表达载体与单靶点表达载体比较,研究RNAi对各组癌细胞增殖的抑制作用。[方法]分别构建了针对Bcl-2、C-Raf和Bcl-2/C-Raf靶基因的质粒表达载体,通过Lipofec-tamineTM2000介导转染人结肠癌细胞系HCT-8后,检测相应转染组靶基因的mRNA和蛋白质表达量,测定各组细胞活性。[结果]分别转染3种质粒表达载体后,3组结肠癌细胞中相应靶基因的mRNA和蛋白质表达量均降低;转染双靶点干扰质粒的试验组;其细胞活性低于单靶点组;对于针对Bcl-2,C-Raf和Bcl-2/C-Raf基因的3组干扰实验,RNAi对结肠癌细胞增殖的抑制率分别为43.87%、40.64%和63.85%。[结论]Bcl-2/C-Raf双靶点的表达载体对结肠癌细胞增殖的抑制作用要明显优于单靶点表达载体。双靶点质粒表达载体在结肠癌的基因治疗中具有很大优势。

bcl-2小分子干扰RNA对人子宫内膜癌RL-952细胞阿霉素敏感性的影响

目的研究靶向bcl-2小分子干扰RNA(siRNA)干扰序列对人子宫内膜癌RL-952细胞阿霉素(DOX)敏感性的影响及相关作用机制。方法 2014年5—8月,将siRNA干扰序列转染人子宫内膜癌RL-952细胞,设3个实验组:空白对照组、bcl-2 siRNA干扰组(转染bcl-2 siRNA干扰序列)及阴性对照组(转染siRNA空载序列),检测bcl-2 siRNA干扰组的转染效率和3组bcl-2表达水平。将细胞随机分成5组,分别为空白对照组、阴性对照组(转染siRNA空载序列)、干扰组(转染bcl-2 siRNA干扰序列)、DOX组(加入5μg/ml DOX)、联合组(转染siRNA干扰序列并加入5μg/ml DOX),检测细胞活力、细胞凋亡率、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平。结果 siRNA干扰序列转染人子宫内膜癌RL-952细胞的转染效率为(94.6±12.5)%。3组bcl-2表达水平比较,差异有统计学意义(F=8.75,P<0.05)。bcl-2 siRNA干扰组bcl-2表达水平低于空白对照组和阴性对照组(q=3.99、2.87,P<0.01)。5组细胞活力比较,差异有统计学意义(F=42.52,P<0.05)。干扰组、DOX组、联合组细胞活力低于空白对照组(q=7.66、8.64、6.89,P<0.05);联合组细胞活力低于DOX组(q=6.76,P<0.01)。5组细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(F=112.34,P<0.05)。干扰组、DOX组、联合组细胞凋亡率高于空白对照组(q=5.78、4.99、6.21,P<0.05);联合组细胞凋亡率高于DOX组(q=4.89,P<0.01)。5组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。干扰组、DOX组、联合组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平高于空白对照组(P<0.05);DOX组、联合组Caspase-3活性高于阴性对照组,干扰组、DOX组、联合组Caspase-9活性高于阴性对照组(P<0.05);联合组Caspase-3活性高于干扰组,DOX组、联合组Caspase-9活性高于干扰组(P<0.05);联合组Caspase-3、Caspase-9活性及细胞色素C水平高于DOX组(P<0.05)。结论靶向bcl-2 siRNA干扰序列可以增强人子宫内膜癌RL-952细胞的DOX敏感性,bcl-2可作为人子宫内膜癌基因治疗的候选靶点。

小干扰RNA对鼻咽癌CNE-2细胞Bcl-2基因的放射增敏研究

目的:探讨Bcl-2基因的特异性小干扰RNA(siRNA)对鼻咽癌细胞的辐射增敏作用。方法:构建Bcl-2基因的特异性siRNA的真核表达载体,并借助脂质体将其转入鼻咽癌CNE-2细胞。荧光显微镜观察转染效率;流式细胞仪检测Bcl-2蛋白在鼻咽癌细胞的表达,并检测CNE-2细胞的凋亡率;流式细胞仪检测Bcl-2基因的特异性siRNA真核表达载体联合X射线照射后CNE-2细胞的凋亡率。结果:流式细胞仪检测结果显示:转染组明显降低了Bcl-2蛋白在CNE-2细胞的表达,且转染组的细胞凋亡率明显增加。转染联合X射线照射后细胞凋亡率也明显增加,且明显高于阴性对照+X射线组和单纯X线照射组。结论:siRNA可以有效干扰鼻咽癌CNE-2细胞内Bcl-2基因的表达,可明显增强鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性。

RNA干扰bcl-2基因质粒载体的构建

目的:构建bcl-2基因的RNA干扰(RNAi)表达载体。方法:根据人bcl-2的基因序列设计短双链3条,人工合成后,连接到带增强型绿色荧光蛋白基因的pGenesil-1载体中,构成3个靶向bcl-2的重组质粒,经酶切、DNA序列测定鉴定,转人HepG-2细胞,观察绿色荧光蛋白表达情况,以确定靶向bcl-2重组质粒进行下一步研究。结果:成功构建了3个靶向bcl-2的shRNA表达载体,为下一步研究奠定基础。结论:靶向shRNA表达载体较其它形式的干扰RNA具更强烈的抑制同源基因表达的作用。

纳米胶束共同递送DOX和Bcl-2 siRNA对MCF-7乳腺癌细胞的杀伤作用

目的制备能同时装载阿霉素(DOX)和Bcl-2siRNA的纳米胶束,利用MCF-7人乳腺癌细胞探讨其细胞毒性和摄取效果。方法还原胺化法和碳二亚胺法合成共聚物聚乙二醇-聚乙烯亚胺-聚L-谷氨酸-γ-苄酯(PEG-PEIPBLG),核磁共振氢谱确认其化学结构。透析法制备空白和载药纳米胶束,透射电子显微镜和动态光散射法表征其形貌和粒径分布;凝胶电泳方法确定纳米胶束压缩Bcl-2siRNA的能力;荧光光谱和透析法探讨纳米胶束释药行为;共聚焦激光扫描显微镜观察纳米胶束被细胞摄取情况;MTT比色法检测细胞毒性。结果 PEG-PEI-PBLG的临界胶束质量浓度约为4mg/L,自组装形成的空白和载药纳米胶束粒径均小于200nm;纳米胶束包埋DOX的载药效率和载药量分别为88.7%和15.1%,载DOX纳米胶束在N/P≥64时可有效压缩Bcl-2siRNA;载DOX和Bcl-2siRNA的纳米胶束的zeta电位为+30mV;DOX和Bcl-2siRNA释放行为具有pH敏感性,其中Bcl-2siRNA释放pH敏感性更强;纳米胶束可将DOX和Bcl-2siRNA同时递送进MCF-7细胞,其细胞毒性高于DOX(P<0.05)。结论 PEGPEI-PBLG纳米胶束能同时装载并递送DOX和Bcl-2siRNA进入MCF-7细胞,显著增强了DOX的细胞毒性,提示该纳米胶束是化疗药和基因物质共同递送的潜在优良载体。

RNA干扰cAMP反应元件结合蛋白对碱性成纤维细胞生长因子诱导的人卵巢癌细胞Bcl-2表达的影响

目的探讨cA MP反应元件结合蛋白(CREB)是否介导碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)诱导的人卵巢癌CAOV3细胞Bcl-2的表达。方法分为①空白对照组,阴性对照组,siRNA CREB组。脂质体转染干扰序列72 h,RT-PCR、Western印迹检测CREB表达并鉴定转染最佳浓度。②对照组,b FGF组,b FGF+siRNA组。转染48 h后饥饿培养24 h。RT-PCR,Western印迹检测Bcl-2表达。倒置显微镜下观察细胞生长及形态改变,MTT法检测细胞增殖。结果①与两对照组相比,siRNA CREB明显抑制CREB mRNA及蛋白表达(P<0.01),100 nmol/L抑制效果最佳。②与对照组相比,b FGF组明显促进细胞生长,上调Bcl-2表达,b FGF+siRNA CREB组则部分抑制b FGF的作用(P<0.01)。结论 b FGF可能部分通过CREB调节人卵巢癌CAOV3细胞Bcl-2的表达,参与细胞的生存及增殖调控。