兔脊髓缺血再灌注损伤时Bcl-xL/Bcl-2相关死亡启动因子的变化及其意义

目的:观察兔脊髓缺血再灌注损伤时Bcl-xL/Bcl-2相关死亡启动因子(Bcl-xL/Bcl-2 associated deathpromoter,BAD)的变化情况,探讨BAD变化的意义。方法:45只新西兰白兔随机分为假手术组(A组,5只)、缺血再灌注组(B组,20只)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)抑制组(C组,20只)。手术前2h,A组及B组动物L4硬膜外注射25%二甲基亚砜(DMSO),C组动物注射溶于25%DMSO的JNK抑制剂SP600125。A组动物麻醉后仅腹腔切开,B组及C组采用腹主动脉阻断法(夹闭腹主动脉30min后松开,再灌注至0.5h、2h、8h、24h)建立脊髓缺血再灌注模型。取L4节段以下脊髓组织,电镜观察神经细胞形态学改变,Western blot检测磷酸化JNK(p-JNK)、JNK、磷酸化BAD(p-BAD)、BAD及细胞色素C的表达,免疫共沉淀检测p-BAD、14-3-3、BAD、Bcl-xL及Bcl-2的表达。结果:电镜检查A组及C组再灌注0.5h未见脊髓神经细胞凋亡,B组再灌注0.5h及C组再灌注2h、8h时偶见脊髓神经细胞凋亡,B组再灌注2h、8h、24h及C组再灌注24h时可见部分脊髓神经细胞凋亡,C组神经细胞凋亡率与同时间点B组比较明显降低(P<0.05)。各组JNK、BAD、14-3-3的表达无明显差异。p-JNK、p-BAD、细胞色素C、Bcl-xL和Bcl-2的表达在A组、B组再灌注0.5h和C组再灌注0.5h、2h、8h无明显差异。B组再灌注2h、8h、24h p-JNK、细胞色素C、Bcl-xL、Bcl-2的表达较A组明显增加(P<0.05),且表达强度随着再灌注时间的延长而增强(P<0.05);C组再灌注24h较A组增加(P<0.05),C组再灌注2h、8h、24h表达量与同时间点B组比较明显降低(P<0.05)。B组再灌注2h、8h、24h时p-BAD较A组明显减少(P<0.05),且表达强度随着再灌注时间的延长而减弱(P<0.05);C组再灌注24h较A组减少(P<0.05),C组再灌注2h、8h、24h表达量与同时间点B组比较明显增加(P<0.05)。结论:兔脊髓缺血再灌注时,BAD被激活,诱发了脊髓神经细胞的凋亡。JNK抑制剂可抑制BAD的活性,减少缺血再灌注损伤过程中脊髓神经细胞的凋亡。

蓝萼甲素对宫颈癌C33A细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的 探讨蓝萼甲素(GLA)对宫颈癌C33A细胞增殖、凋亡的影响及其机制。方法 将对数生长期宫颈癌C33A细胞随机分为阴性对照组、5μmol·L^(-1)GLA组、10μmol·L^(-1)GLA组、20μmol·L^(-1)GLA组、40μmol·L^(-1)GLA组,阴性对照组细胞不加任何药物干预,5μmol·L^(-1)GLA组、10μmol·L^(-1)GLA组、20μmol·L^(-1)GLA组、40μmol·L^(-1)GLA组细胞分别加入终浓度为5、10、20、40μmol·L^(-1)GLA进行干预。分别于培养24、48、72 h时,采用3,3′-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠法检测5组细胞的增殖抑制率;于培养48 h时,采用流式细胞术检测阴性对照组、5μmol·L^(-1)GLA组、10μmol·L^(-1)GLA组、20μmol·L^(-1)GLA组细胞凋亡率,Western blot法检测阴性对照组、5μmol·L^(-1)GLA组、10μmol·L^(-1)GLA组、20μmol·L^(-1)GLA组细胞中磷酸化B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(p-BAD)和10号染色体缺失与张力蛋白同源磷酸酶(PTEN)蛋白相对表达量。结果 培养24、48、72 h时,5μmol·L^(-1)GLA组、10μmol·L^(-1)GLA组、20μmol·L^(-1)GLA组、40μmol·L^(-1)GLA组细胞增殖抑制率显著高于阴性对照组,10μmol·L^(-1)GLA组、20μmol·L^(-1)GLA组、40μmol·L^(-1)GLA组细胞增殖抑制率显著高于5μmol·L^(-1)GLA组,20μmol·L^(-1)GLA组、40μmol·L^(-1)GLA组细胞增殖抑制率显著高于10μmol·L^(-1)GLA组,40μmol·L^(-1)GLA组细胞增殖抑制率显著高于20μmol·L^(-1)GLA组(P<0.05)。不同浓度GLA组细胞培养48、72 h时的增殖抑制率显著高于培养24 h时,培养72 h时的增殖抑制率显著高于培养48 h时(P<0.05)。5μmol·L^(-1)GLA组、10μmol·L^(-1)GLA组、20μmol·L^(-1)GLA组细胞凋亡率显著高于阴性对照组,10μmol·L^(-1)GLA组、20μmol·L^(-1)GLA组细胞凋亡率显著高于5μmol·L^(-1)GLA组,20μmol·L^(-1)GLA组细胞凋亡率显著高于10μmol·L^(-1)GLA组(P<0.05)。5μmol·L^(-1)GLA组、10μmol·L^(-1)GLA组、20μmol·L^(-1)GLA组细胞中p-BAD蛋白相对表达量显著低于阴性对照组,PTEN蛋白相对表达量显著高于阴性对照组(P<0.05);10μmol·L^(-1)GLA组、20μmol·L^(-1)GLA组细胞中p-BAD蛋白相对表达量显著低于5μmol·L^(-1)GLA组,PTEN蛋白相对表达量显著高于5μmol·L^(-1)GLA组(P<0.05);20μmol·L^(-1)GLA组细胞中p-BAD蛋白相对表达量显著低于10μmol·L^(-1)GLA组,PTEN蛋白相对表达量显著高于10μmol·L^(-1)GLA组(P<0.05)。结论 GLA可通过上调PTEN蛋白、降低p-BAD的表达,抑制C33A细胞增殖,促进C33A细胞凋亡,且呈剂量依赖性。

BAD与JNK协同调节UV诱导的细胞凋亡

JNK和BAD(bcl-2相关死亡启动子)都是参与细胞凋亡的重要调控蛋白.然而,二者在功能上的联系及其在细胞凋亡中的相互作用尚未见报导.本研究证明,BAD可作为JNK的磷酸化底物,与JNK相互作用,协同调节紫外线(UV)诱导的细胞凋亡.蛋白质印迹检测PARP(聚ADP核糖聚合酶)裂解,以及流式细胞术检测细胞凋亡结果揭示,UV诱导的MEF细胞凋亡依赖JNK的激酶活性.siRNA敲降BAD的蛋白表达,可增加MEF细胞对UV诱导的细胞凋亡的敏感性.UV处理的野生型MEF细胞抽提液(含JNK激酶活性)可催化GST-BAD底物发生磷酸化修饰,而UV未处理的细胞抽提液却不能.结果提示,UV激活的JNK活性可催化BAD磷酸化;体外合成的持续活化的JNK与GST-BAD体外共孵育结合质谱分析证明,JNK可催化BAD蛋白的Thr-201磷酸化.提示BAD是JNK的底物.此外,野生型和T201A突变的BAD质粒转染BAD-/-细胞结果显示,BAD的T201磷酸化可抑制JNK激酶活性及其底物c-Jun的磷酸化,提示BAD磷酸化对JNK具有负反馈调节作用.上述结果证明,BAD作为底物可被UV激活的JNK激酶磷酸化;磷酸化BAD反过来又可抑制JNK的激酶活性,负性调节细胞凋亡.综上所述,BAD与JNK能够相互影响,协同调控UV诱导的细胞凋亡.

PTEN/PI3K信号通路在大鼠心肌肥厚中的表达

目的：观察PTEN/PI3K信号通路在大鼠心肌组织中的表达,探讨该通路在心肌肥厚发生、发展中的作用.方法：皮下注射异丙肾上腺素（ISO）建立大鼠心肌肥厚模型,测定大鼠体质量、心质量、心肌细胞横径和横截面积;采用免疫组织化学方法检测大鼠心肌组织中肥大标志因子β-肌球蛋白（β-MHC）及PTEN/PI3K信号通路上PTEN、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（PKB）、死亡相关因子（BAD）蛋白表达;利用计算机图像处理系统对各种蛋白进行定量分析.结果：模型组大鼠全心质量/体质量、左室质量/体质量、心肌细胞横径、心肌细胞截面积较对照组明显增加.模型组大鼠的心肌组织与对照组相比,β-MHC、PI3K与PKB表达水平均升高,PTEN和BAD表达水平明显降低.结论：PTEN在心肌肥厚中表达明显降低,起负性调节作用;PI3K/PKB信号通路激活,可能是导致心肌肥厚的机制之一,BAD可望成为生物学治疗靶点.

脑缺血预处理诱导海马CA1区神经元Bad磷酸化及其蛋白表达的变化

目的： 观察大鼠脑缺血预处理（CIP）后不同时间点海马CA1区胞质及线粒体中Bcl-xl/Bcl-2相关死亡促进因子（Bad）和p-Bad蛋白水平变化,探讨其在缺血耐受机制中的作用.方法： 采用SD大鼠4动脉结扎全脑缺血模型,利用焦油紫染色、免疫印迹法检测神经元的损伤及蛋白表达.结果： 焦油紫染色显示,脑缺血再灌注（I/R）3d,CA1区神经元大量损伤,与I/R组相比,CIP组CA1区存活的神经元增加;免疫印迹结果显示,CIP组胞质中Bad磷酸化水平于再灌注3h和3d出现高峰,而其蛋白表达无明显变化;与I/R对应时间点相比,CIP后再灌注3h和3d p-Bad升高.CIP后线粒体中p-Bad在再灌注不同时间点无明显变化,而其蛋白表达在再灌注后期（6h～3d）逐渐下降.结论： 脑缺血预处理可有效减轻海马CA1区神经元损伤;同时诱导神经元胞质中p-Bad蛋白水平升高,线粒体Bad蛋白表达降低.脑缺血预处理后Bad线粒体转位的降低可能是缺血耐受的重要机制.

爱康方含药大鼠血清对人肺腺癌A549细胞内Bad、Caspase-9蛋白及mRNA的作用

目的 探讨爱康方含药血清对人肺腺癌A549细胞内B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(Bad)、Caspase-9蛋白(Caspase-9蛋白)及mRNA的表达作用。方法 40只大鼠,采用随机分组法分为空白对照组(NS)、环磷酰胺组(CTX)、爱康方组(AKF)和爱康方联合环磷酰胺组(AC),每组10只。以人肺腺癌A549细胞为研究对象,依据前期研究结果选定20%的含药血清为最佳干预浓度,用各组含药血清分别干预细胞48、72 h后收集细胞用于检测。通过蛋白质印迹法(Western blot)测定干预后目的细胞中Bad、Caspase-9蛋白表达,实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)法测定Bad、Caspase-9 mRNA的表达。比较各组不同方法检测的Bad mRNA、Caspase-9 mRNA表达水平及Bad、Caspase-9蛋白表达水平。结果 48、72 h时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad mRNA表达水平高于空白对照组,爱康方联合环磷酰胺组Bad mRNA表达水平高于环磷酰胺组和爱康方组,差异具有统计学意义(P<0.05);48 h时,环磷酰胺组Bad mRNA表达水平高于爱康方组,差异具有统计学意义(P<0.05)。72 h时,爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad mRNA表达水平高于本组48 h,差异具有统计学意义(P<0.05)。48、72 h时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 mRNA表达水平高于空白对照组,爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 mRNA表达水平高于环磷酰胺组和爱康方组,差异具有统计学意义(P<0.05);48 h时,环磷酰胺组Caspase-9 mRNA表达水平高于爱康方组,差异具有统计学意义(P<0.05)。72 h时,爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9 mRNA表达水平高于本组48 h,差异具有统计学意义(P<0.05)。48、72 h时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad蛋白表达水平明显高于空白对照组,环磷酰胺组、爱康方联合环磷酰胺组高于爱康方组,爱康方联合环磷酰胺组高于环磷酰胺组,差异具有统计学意义(P<0.05)。72 h时,爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Bad蛋白表达水平高于本组48 h,差异有统计学意义(P<0.05)。48、72 h时,环磷酰胺组、爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9蛋白表达水平明显高于空白对照组,环磷酰胺组、爱康方联合环磷酰胺组高于爱康方组,爱康方联合环磷酰胺组高于环磷酰胺组,差异具有统计学意义(P<0.05)。72 h时,爱康方组和爱康方联合环磷酰胺组Caspase-9蛋白表达水平高于本组48 h,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 爱康方能抑制肺癌肿瘤生长,与环磷酰胺合用抑癌效果更佳,可能是通过上调A549细胞中促凋亡蛋白Bad、Caspase-9,诱导肿瘤细胞凋亡而实现的。

Correlation of serum PDCD5 and Bax contents with the pathological features of tumor lesions in patients with lung cancer

Objective:To study the correlation of serum PDCD5 and Bax contents with the pathological features of tumor lesions in patients with lung cancer.Methods:Patients with lung cancer who underwent surgical treatment in West China Hospital between June 2014 and March 2017 were selected as the lung cancer group for the study, the serum specimens were collected before surgery, and the lung cancer lesion and adjacent lesion were taken after surgery;the healthy subjects who underwent physical examination in West China Hospital during the same period were selected as the control group, and the serum samples were taken during the physical examination;the contents of PDCD5 and Bax in serum as well as the contents of PDCD5 and Bax, and the expression of proliferation genes and invasion genes in the lung cancer lesion and adjacent lesion were measured.Results: PDCD5 and Bax contents in serum of lung cancer group were significantly lower than those of control group, PDCD5 and Bax contents in lung cancer lesion were significantly lower than those in adjacent lesion, and the PDCD5 and Bax contents in serum of patients with lung cancer were positively correlated with the PDCD5 and Bax contents in lung cancer lesion;C-myc, RACK1, CatL, MMP2 and N-cadherin mRNA expression in lung cancer lesion were significantly higher than those in adjacent lesion and negatively correlated with PDCD5 and Bax contents in serum whereas LAST1, PAQR3, TCF21, E-cadherin, TIMP1 and TIMP2 mRNA expression were significantly lower than those in adjacent lesion and positively correlated with PDCD5 and Bax contents in serum. Conclusion:The decrease of PDCD5 and Bax in serum of patients with lung cancer is closely related to the aggravation of cancer cell proliferation and invasion in tumor lesions.

香砂六君子汤对慢性萎缩性胃炎大鼠的作用研究

目的研究香砂六君子汤对慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠胃组织Bcl-2相关凋亡促进因子(BAD)、B淋巴细胞瘤-XL(Bcl-XL)、Bcl-2相关X蛋白(BAX)基因及其蛋白表达水平的影响。方法用综合法复制CAG动物模型。按随机数字表法将造模成功Wistar大鼠随机分为5组:模型组、对照组和高、中、低3个剂量实验组;另取正常大鼠作为正常组,每组均20只。正常组和模型组大鼠给予馏水灌胃,高、中、低3个剂量实验组分别给予香砂六君子汤24,12,6g·kg^-1·d^-1灌胃,对照组给予维酶素0.30 g·kg^-1·d^-1灌胃,持续给药120 d。用免疫印迹法检测BAD、Bcl-XL和BAX蛋白表达水平(灰度值),用实时荧光定量聚合酶链反应法检测BAD、Bcl-XL和BAX基因表达水平(荧光值)。结果正常组、模型组、对照组和高、中、低3个剂量实验组的BAD蛋白表达量分别为0.24±0.06,1.23±0.28,0.58±0.07,0.41±0.13,0.80±0.10和1.07±0.20;这6组的Bcl-XL蛋白表达量分别为0.42±0.02,2.52±0.29,0.84±0.09,0.47±0.02,0.85±0.16和2.01±0.26;这6组的BAX蛋白表达量分别为1.17±0.37,0.36±0.05,0.51±0.07,1.07±0.21,0.59±0.09和0.44±0.05。上述指标:模型组与正常组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01);高剂量实验组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。基因表达结果与蛋白表达的趋势一致。结论香砂六君子汤通过上调胃组织BAX基因及其蛋白表达,下调BAD、Bcl-XL基因及其蛋白表达,达到影响CAG的作用。