球孢白僵菌羧基转运蛋白基因BbJEN1及其上游序列的克隆与分析

在分析一株球孢白僵菌T DNA插入突变体T12的Tagging序列的基础上 ,根据与其具有高度同源性的一条金龟子绿僵菌EST序列 (编号为AJ2 732 2 6 )设计简并引物 ,用YADE法从球孢白僵菌中扩增出该EST的同源序列及其延伸序列。序列分析表明 ,该片段与粗糙脉孢霉的羧基转运蛋白JEN1具有高度同源性 ,由此确定该序列为球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1基因的部分序列。然后利用YADE法延伸扩增该序列的上、下游序列 ,获得球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1的全长DNA序列 ,命名为GBbJEN1。利用 3′ RACE扩增出球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1的cDNA序列 ,命名为BbJEN1。BbJEN1全长 16 5 6bp ,编码 5 14个氨基酸的蛋白。推测蛋白分子量为 5 5 975 .37Da,等电点 9.32。氨基酸序列与金龟子绿僵菌、粗糙脉孢霉和酿酒酵母羧基转运蛋白JEN1的同源性分别为 77%、6 6 %和30 %。序列分析表明 ,GBbJEN1含有 2个内含子。Southern杂交表明 ,GBbJEN1基因在球孢白僵菌基因组中为单拷贝。利用RT PCR法对BbJEN1的表达特性进行了分析 ,结果发现BbJEN1基因的转录受蟑螂壳、蝉蜕等昆虫体壁的诱导 ,受葡萄糖的抑制。进一步利用YADE法获得了长为 977bp的GBbJEN1上游序列 ,其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列和压力反应元件。

锌离子响应转录激活因子ZafA对球孢白僵菌锌离子利用及生防潜能的影响

球孢白僵菌作为丝孢类昆虫病原真菌,已广泛应用于农林害虫的生物防治,但是田间多变的环境影响了真菌制剂的效能。此外,真菌侵染宿主后,宿主体内的环境也影响真菌的增殖和侵染速度。为研究球孢白僵菌对环境中酸碱度及微量元素的平衡能力,本研究初步探讨了锌离子响应转录激活因子ZafA与真菌生长繁殖、抗逆能力、毒力以及锌离子利用的关系。结果表明,敲除zafA削弱了真菌生长繁殖和孢子萌发的能力,增加了菌株对氧化、高渗、孢壁干扰剂以及紫外胁迫的敏感性,杀虫毒力显著下降,并抑制了相关性状基因的表达水平。基因敲除菌株无法在锌离子缺失的条件下生长,且zafA基因和锌离子转运蛋白编码基因zrf1–8的表达水平会受到酸碱度以及锌离子浓度的影响。由此可见,ZafA不仅直接影响球孢白僵菌利用锌离子的能力,还与球孢白僵菌抗逆能力和毒力密切相关,本研究为提高生防真菌环境适应性和发挥毒力提供新的依据。

比较两种昆虫病原真菌中结构相似的ATP结合匣转运蛋白的抗氧化力与多药抗性

【目的】比较分析球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BbT1和玫烟棒束孢(Isaria fumosorosea)IfT1两种结构相似的ATP结合匣转运蛋白的生物学功能。【方法】基于Bb2860野生株构建BbT1的敲除株和回补株,并将IfT1在BbT1敲除株中异源重组表达,比较各菌株的表型变化。【结果】与野生株、回补株及异源重组株相比,敲除株对20-40 mmol/L过氧化氢和2-8 mmol/L甲萘醌氧化胁迫的抵抗力下降27%-2.1倍,对多菌灵、伊曲康唑、菌核净、放线菌酮、乙嘧酚和4-硝基喹啉N-氧化物等不同类型化学药物的抗药性下降28%-4.7倍,对斜纹夜蛾Spodoptera litura二龄幼虫的毒力下降20%左右,而野生株、回补株及异源重组株之间无任何表型的显著差异。【结论】BbT1和IfT1是结构相似且功能一致的转运蛋白,分别是两种生防真菌多药抗性的决定因子之一,因参与抗氧化反应而对毒力有所贡献。