针刺通过PI3K-Ⅲ/Beclin-1通路抑制脑缺血-再灌注损伤大鼠的细胞凋亡

目的:利用大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)法制备大鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)模型,研究针刺对CIRI模型大鼠脑组织中Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K-Ⅲ)/Beclin-1通路的影响。方法:利用MCAO/R方法制备SD大鼠CIRI模型,分别给予针刺和(或)自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)进行治疗。利用采用Garcia评分法检测大鼠神经功能,TTC染色法检测大鼠脑梗死面积,Western Blot法检测海马组织PI3K-Ⅲ、Beclin-1和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白的表达水平,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:MCAO/R手术后大鼠神经功能评分降低(P<0.01),TTC染色观察到脑梗死,同时海马区PI3K-Ⅲ、Beclin-1和Bcl-2表达显著下调(P<0.01),脑皮质细胞凋亡增多(P<0.01)。针刺治疗不但提高了大鼠神经功能评分(P<0.01),并且减少了脑梗死面积(P<0.01);同时显著上调了海马组织中PI3K-Ⅲ、Beclin-1和Bcl-2表达(P<0.01),并减少了脑细胞凋亡(P<0.01)。3-MA阻断了针刺的治疗作用,而且使脑损伤更加严重。结论:针刺可改善CIRI大鼠神经功能并减轻神经损伤,其机制可能与激活PI3K-Ⅲ/Beclin-1通路增加细胞自噬并减少细胞凋亡有关。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C对脑缺血再灌注大鼠Bcl-2、Bax和Beclin-1的表达及细胞凋亡的影响

目的:应用不同浓度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C,Cys C)干预脑缺血再灌注大鼠,检测Bcl-2、Bax、Beclin-1阳性细胞的表达,探讨自噬蛋白Beclin-1与凋亡之间的关系。方法:成年雄性SD大鼠随机分成假手术组(Sham组),缺血再灌注组(I/R组),Cys C低、中、高浓度组。用线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,缺血2 h再灌注24 h。采用免疫印迹半定量检测损伤中心脑皮质组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Beclin-1的表达;免疫组织化学检测Bcl-2、Bax和Beclin-1阳性细胞数;TUNEL染色法检测脑组织细胞凋亡。结果:与I/R组相比,Cys C低、中浓度组Bcl-2的表达有不同程度的升高,Bax的表达降低,细胞凋亡减少;而Cys C高浓度组Bcl-2的表达明显降低,Bax的表达显著上升,细胞凋亡增加;Cys C各浓度组Beclin-1的表达都有不同程度的升高。凋亡细胞与Beclin-1表达的相关性分析显示,Cys低、中浓度组细胞的自噬和凋亡呈负相关;Cys C高浓度组细胞的自噬和凋亡呈正相关。结论:Cys C在一定浓度范围内,随自噬蛋白Beclin-1表达的升高可抑制细胞的凋亡,对缺血再灌注损伤脑组织具有保护作用。其作用机制和Bcl-2的表达上调,Bax的表达下调有关;而Cys C较高浓度则无上述作用。

调肝理脾法对大鼠非酒精性脂肪性肝病脂质代谢和自噬相关蛋白-1表达的影响

目的:观察调肝理脾法(MRLS)对实验性大鼠非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的改善作用及对大鼠肝组织自噬相关蛋白Beclin1表达的影响,探讨调肝理脾法治疗非酒精性脂肪肝病的可能作用机制。方法:SD雄性大鼠(清洁级) 30只,随机分为对照组、模型组、调肝理脾组(各10只)。模型组、调肝理脾组大鼠皆予以高脂饮食共12周。调肝理脾法组大鼠造模同时给予调肝理脾方2ml/100g/d灌胃(相当于成人剂量的5倍),对照组大鼠给予正常饮食(普通饲料)及等量生理盐水灌胃。第12周末处死动物后,分别采集大鼠血液、肝脏标本,检测各组大鼠血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平,通过HE染色观察肝脏脂肪变性情况,免疫组化法检测Beclin1在肝组织中表达的变化。结果:(1)HE染色提示模型组大鼠肝细胞脂肪变性程度和炎症活动度计分与正常对照组相比,差异有统计学意义(P <0. 001);调肝理脾法组脂肪变性程度和炎症活动度计分明显减轻,与模型组相比差异有统计学意义(P <0. 01)。(2)与对照组比较,模型组大鼠血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C的水平均升高,差异有统计学意义(P <0.001)。与模型组比较,除HDL-C外,调肝理脾法组大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C的水平均降低,差异有统计学意义(P <0.05)。(3)与对照组比较,模型组大鼠肝组织Beclin1蛋白表达水平略增高,差异无统计学意义(χ2=1. 250,P> 0. 05);与模型组比较,调肝理脾法组肝组织Beclin1蛋白表达水平明显增高,差异有统计学意义(χ2=6. 121,P <0. 05)。结论:调肝理脾法对实验性大鼠非酒精性脂肪肝病的肝功能、血脂等指标有很好的改善作用,其作用机制可能与升高大鼠肝组织内的自噬水平有关。

调肝理脾法对非酒精性脂肪肝病大鼠脂质代谢和自噬相关蛋白-1表达的影响

目的：观察调肝理脾法（MRLS）对实验性大鼠非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的改善作用及对大鼠肝组织自噬相关蛋白Beclin-1表达的影响，探讨调肝理脾法治疗非酒精性脂肪肝病的可能作用机制。方法：SD雄性大鼠（清洁级）30只，随机分为对照组、模型组、调肝理脾组（n=10）。模型组、调肝理脾组大鼠皆给予高脂饮食共12周。调肝理脾法组大鼠造模同时给予调肝理牌方2ml／100g／d灌胃，对照组大鼠给予正常饮食（普通饲料）及等量生理盐水灌胃。第12周末处死动物后，分别采集大鼠血液、肝脏标苓，检测各组大鼠血清ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平，通过HE染色观察肝脏脂肪变性情况，免疫组化法检测Beclinl在肝组织中表达的变化。结果：①HE染色提示模型组大鼠肝细胞可见严重脂肪变性，调肝理睥法组大鼠部分肝细胞可见脂肪变性，其脂肪变性程度低于模型组，差异有统计学意义（P〈0．05），正常对照组大鼠无脂肪变性。②除HDL-C外，模型组大鼠血清AlIrr、AST、TG、TC、LDL—C的水平与正常对照组比较均升高，差异有统计学意义（P〈0．05）；除HDL—C外，调肝理脾法组大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C的水平与模型组比较均降低，差异有统计学意义（P〈0．05）。⑧模型组大鼠肝组织Beclin-1蛋白表达水平与正常对照组比较略增高，但差异无统计学意义（P〉0．05），与模型组比较明显增高，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：调肝理牌法对买验性非酒精性脂肪肝病大鼠的肝功能、血脂等指标有很好的改善作用，其作用机制可能与升高大鼠肝组织内的自噬水平有关。

自噬在顺铂致宫颈癌Hela细胞死亡中的作用

目的:研究自噬在顺铂致宫颈癌Hela细胞死亡中的作用,以及自噬基因Beclin 1对Hela细胞顺铂敏感性的影响。方法:不同浓度顺铂作用Hela细胞后,丹磺酰戊二胺(MDC)法观察细胞中自噬体的形成,蛋白质印迹法(Western blot)检测自噬基因Beclin 1和LC3蛋白的表达;将自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Beclin1转染Hela细胞,Western blot检测Beclin 1在Hela细胞中的蛋白表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测顺铂对Hela半数抑制浓度(IC50)的变化,流式细胞仪检测自噬细胞与凋亡细胞的百分率。结果:顺铂作用Hela细胞后,细胞内自噬体形成增加,自噬蛋白Beclin 1和LC3表达增加,且均呈现浓度依赖性(P<0.05);pcDNA3.1(+)-Beclin 1转染Hela细胞后,Beclin 1蛋白表达增加(P<0.05),MTT检测IC50由转染前的1.0 mg/L下降到0.5 mg/L,凋亡细胞百分率和自噬细胞百分率均升高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:自噬参与了顺铂对宫颈癌Hela细胞的细胞毒性作用,自噬基因Beclin 1过表达能够增加Hela细胞对顺铂的敏感性。

自噬与胃癌相关肿瘤基因的作用研究

自噬是一个保守的依赖溶酶体的降解途径,可降解长寿命蛋白质、细胞器和部分细胞质,是细胞内的再循环系统。自噬对肿瘤的发展过程扮演双重角色,在肿瘤发生早期,自噬能抑制癌前细胞的持续生长而减少肿瘤的发生;当肿瘤进展到中晚期阶段时,肿瘤细胞可利用自噬机制对抗营养缺乏和缺氧而获得生存。自噬与胃癌的发生、发展有非常密切的联系,但与胃癌发生的详细机制尚不清楚。该文就自噬与胃癌相关肿瘤基因之间的作用关系予以综述,希望能对胃癌的预防和诊治提供新的策略。

外周血单核细胞自体吞噬相关基因表达与高血压颈动脉IMT的关系

目的研究高血压患者外周血单核细胞的自体吞噬相关蛋白与颈动脉内膜中层厚度(IMT)的关系。方法 99例高血压患者分为对照组53例和IMT增厚组46例,用RT-PCR方法检测2组外周血单核细胞中自噬相关基因Beclin-1和LC3mRNA的表达,用Western blot技术检测相应蛋白的表达水平。结果 IMT增厚组自噬基因Beclin-1、LC3 ⅡmRNA(2.19±0.84)、(2.49±0.94)较对照组(1.00±0.37)、(1.02±0.44)表达升高(P<0.01),相应蛋白IMT增厚组Beclin-1(1.80±0.67)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(1.90±0.68)表达较对照组Beclin-1(1.07±0.32)、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(0.91±0.23)表达升高(P<0.05)。结论高血压颈动脉IMT增厚患者外周血自噬相关蛋白Beclin-1和LC3的mRNA及相应蛋白表达增强,可能参与了颈动脉IMT增厚的进展。

Beclin1与PTEN在鼻咽癌中的表达及相关性研究

目的检测Beclin1、PTEN在鼻咽癌组织中的表达水平,分析自噬蛋白Beclin1与凋亡相关蛋白PTEN在鼻咽癌发生发展中的作用及临床意义。方法应用免疫组织化学方法检测50例鼻咽癌、20例癌旁黏膜和15例鼻咽黏膜慢性炎组织中Beclin1和PTEN蛋白表达,并分析其与临床分期、病理组织类型和转移的关系。结果Beclin1在鼻咽癌、癌旁黏膜和鼻咽黏膜慢性炎组织中阳性表达率分别为38.0%、65.0%、93.3%,PTEN的阳性表达率分别为34.0%、85.0%、93.3%,Beclin1和PTEN蛋白表达程度都与鼻咽癌临床分期、组织学分型和颈部淋巴结转移相关(P<0.05),且Beclin1与PTEN在鼻咽癌中的表达呈正相关(rs=0.946,P<0.05)。结论鼻咽癌组织中Beclin1、PTEN低表达与鼻咽癌发生、发展相关,检测其表达对研究鼻咽癌发生、发展有重要的作用,并可作为患者预后判断的重要标志物。

E-64d对反复惊厥发育期大鼠大脑皮质Beclin-1蛋白表达的影响

目的探讨反复惊厥发育期大鼠大脑皮质中自噬标记蛋白Beclin-1的表达及溶酶体酶抑制剂E-64d对其表达的干预作用。方法将出生21d的SD大鼠随机分成3组,每组24只。惊厥组大鼠隔日腹腔注射青霉素(4.8×106U·kg-1·d-1),连续6次,诱导惊厥发作;对照组大鼠予同等剂量的9g·L-1盐水腹腔注射;E-64d组于每次惊厥前腹腔注射4μLE-64d,采用同样方法腹腔注射青霉素诱导惊厥发作。于末次惊厥后3h、12h、24h和出生51d(P51)处死3组大鼠,并取其大脑皮质,采用免疫印迹技术分别检测3组大鼠大脑皮质中Beclin-1蛋白的表达。应用SPSS16.0软件进行统计学分析。结果惊厥组大鼠3h、12h、24h Beclin-1蛋白的表达均明显高于对照组同一时间点Beclin-1蛋白的表达(Pa<0.05)。E-64d组3h、12h、24h Beclin-1蛋白的表达明显低于惊厥组同一时间点Beclin-1蛋白的表达(Pa<0.05)。3组P51时Beclin-1蛋白表达比较差异均无统计学意义(Pa>0.05)。结论惊厥后急性期Beclin-1蛋白水平明显上调表明自噬途径被激活,且E-64d参与自噬途径的调控。

PI3KC3/Beclin1复合物对染矽尘NR8383细胞自噬的调控作用

[目的]探讨PI3KC3/Beclin1复合物在染矽尘大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)自噬中的调控作用。[方法]常规培养NR8383细胞,随机分为4组:对照组,矽尘组,3-MA组和3-MA干预组,分别孵育1、3、6、12、20 h后收集样品。采用蛋白免疫印迹方法检测自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬底物蛋白p62以及自噬相关蛋白Beclin1、PI3KC3;采用激光扫描共聚焦显微镜观察孵育不同时间的自噬免疫荧光表达情况;采用免疫共沉淀检测Beclin1复合物表达。[结果]免疫荧光结果显示,矽尘组LC3点状聚集绿色荧光亮斑随时间先增强后减弱,在6 h时荧光最强,且各时间点较对照组和3-MA干预组荧光亮斑增强;3-MA干预组LC3荧光标记绿色亮斑先增强后减弱,弱于矽尘组,但强于对照组。加入溶酶体抑制剂二磷酸氯喹后,各组LC3绿色荧光信号随时间均呈现增强的趋势。Western blot结果显示,矽尘组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值呈先增加后减少趋势,且在各个时间点均高于对照组(P <0.05);在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值达最高的6 h时间点,矽尘组的值是对照组的248%,是3-MA组的372%。3-MA干预组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值也呈先增加后减少趋势;除1 h时间点外,余各时间点均低于矽尘组,但高于对照组(P <0.05);在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值达最高的6 h时间点,3-MA干预组的值是矽尘组的90%,是对照组的223%。Beclin1、PI3KC3蛋白表达趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值一致,p62蛋白表达趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值相反。免疫共沉淀显示,矽尘组Beclin1与PI3K结合增加,3-MA干预后两者结合减少。[结论]矽尘诱导NR8383细胞的自噬活动随时间发生不同程度的改变,3-MA可下调矽尘诱导的NR8383细胞自噬活动,推测PI3KC3/Beclin1信号通路参与矽尘诱导肺泡巨噬细胞的自噬过程。

细胞自噬基因Beclin 1与惊厥性脑损伤的相关性

自噬是细胞内物质代谢的重要途径,是真核细胞中广泛存在着的降解再循环系统的重要组成部分,其可作为神经细胞的保护机制,也可作为神经细胞死亡方式之一。Beclin 1是最近发现参与细胞自噬调控的蛋白之一,参与自噬体形成的启动过程,与某些疾病如肿瘤、惊厥性脑损伤的发生等密切相关。惊厥是儿科常见的急重症,反复的惊厥性损伤不但影响患儿的智力发育,而且严重惊厥可引起永久性脑损伤,甚至留有后遗症,给患儿及家庭带来沉重打击。最近研究表明,反复惊厥后海马Beclin1表达迅速上调,自噬激活与惊厥导致的脑损伤密切相关。Beclin1作为重要的细胞自噬基因。