染料木素逆转肝癌Bel-7402/5Fu细胞耐药性的机制研究

目的:探讨染料木素逆转肝癌Bel-7402/5Fu细胞耐药性的机制。方法:通过CCK-8法检测染料木素对肝癌Bel-7402/5Fu细胞的杀伤作用。通过蛋白印迹和qPCR法检测染料木素作用后自噬关键基因Beclin1和LC3的表达水平。通过蛋白印迹法检测自噬上游信号通路蛋白Akt和mTOR的活化水平。结果:染料木素能够抑制肝癌Bel-7402/5Fu细胞增殖,并呈剂量依赖性,IC50为30.0±5.9μg/mL。选取低浓度染料木素作用于Bel-7402/5Fu细胞后,再用5Fu处理细胞,发现细胞对5Fu的耐受能力降低。蛋白印迹结果显示,染料木素处理显著降低了细胞自噬关键基因Beclin1和LC3的表达水平,显著上调自噬抑制性通路PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt和mTOR的活化水平。结论:染料木素能够降低肝癌Bel-7402/5Fu细胞对5Fu的耐受性,即染料木素处理逆转了肝癌Bel-7402/5Fu细胞的耐药性。该过程可能与染料木素通过上调PI3K/Akt/mTOR信号通路而抑制细胞自噬相关。

山萘酚逆转肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu的作用机制研究

目的探讨山萘酚(KAE)对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu功能的影响。方法采用KAE处理Bel-7402/5-Fu细胞,将细胞分为对照组和药物组(0.064、0.320、1.600、8、40、200μmol/L KAE);根据干扰DNA依赖性激酶催化亚基(DNA-PKcs)、加入蛋白酶体抑制剂MG132或加入自噬抑制剂CQ,将细胞分为si-NC组和DNA-PKcs干扰(siRNA-1664、siRNA-2142、siRNA-3785)组,对照组、KAE组和KAE+si-DNA-PKcs组,对照组、KAE+DMSO组、KAE+MG132组和KAE+CQ组。采用CCK-8检测细胞增殖,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot检测组蛋白H_(2)AX磷酸化(γ-H_(2)AX)、DNA-PKcs、DNA双链断裂修复/V(D)J重组蛋白(Artemis)和药泵基因(P-gp)mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,蛋白稳定性实验检测DNA-PKcs蛋白稳定性,免疫共沉淀检测DNA-PKcs蛋白泛素化。结果与对照组相比,8μmol/L KAE处理细胞24 h可抑制约50%的细胞增殖能力,选择此时间和浓度进行后续研究。与对照组相比,KAE组γ-H_(2)AX mRNA和蛋白表达水平升高,DNA-PKcs、Artemis和P-gp mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05);与对照组相比,KAE促进Bel-7402/5-Fu细胞周期阻滞于G2/M期,增加细胞凋亡;与si-NC组相比,siRNA-1664能显著下调DNA-PKcs mRNA和蛋白表达水平(P<0.05);与KAE组相比,KAE+si-DNAPKcs组进一步促进了KAE对细胞的效应;与对照组相比,KAE+DMSO组DNA-PKcs蛋白表达水平降低(P<0.05);与KAE+DMSO组相比,KAE+MG132组DNA-PKcs蛋白表达水平升高(P<0.05),而KAE+CQ组DNA-PKcs蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);与对照组相比,KAE+DMSO组促进DNA-PKcs蛋白的泛素化,而KAE+MG132组则可抑制其泛素化(P<0.05)。结论KAE能够诱导肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu的细胞凋亡和细胞周期阻滞。

沉默DNA依赖蛋白激酶亚基对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA损伤修复功能的影响

目的探讨DNA依赖蛋白激酶亚基(DNA-PKcs)基因沉默后对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA损伤修复功能的影响。方法采用阳离子脂质体法将sh DNA-PKcs干扰质粒转染Bel-7402/5-Fu细胞,根据荧光细胞数计算转染率,实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)及Western blot检测DNA-PKcs的沉默效率;Western blot检测TopoⅡ、γ-H2AX蛋白表达;5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷法检测细胞DNA合成。结果质粒的转染效率为67%;q RT-PCR及Western blot检测结果显示,DNA-PKcs m RNA及蛋白水平的沉默效率分别为82.6%和71.8%;Western blot结果显示,实验组TopoⅡ蛋白表达水平比对照组低,差异有统计学意义(P<0.05),γ-H2AX蛋白表达水平比对照组高,差异有统计学意义(P<0.01)。5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷法结果显示,实验组DNA合成率比对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 sh DNA-PKcs干扰质粒能下调Bel-7402/5-Fu细胞中DNA-PKcs、TopoⅡ蛋白的表达,抑制Bel-7402/5-Fu细胞DNA合成。

MiRNA-122对5-氟尿嘧啶诱导BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响

目的探讨微水RNA-122(miR-122)对5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响。方法构建miR-122和阴性对照质粒瞬时转染至BEL-7402/5-FU细胞;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测caspase-8,caspase-9和caspase-3蛋白表达水平。结果仅用miR-122处理BEL-7402/5-FU细胞时,与未转染组和转染对照组比较,miRNA-122转染组细胞凋亡率增加,用10μmol/m L 5-FU作用BEL-7402/5-FU细胞24 h后,与未转染组和转染对照组比较,miR-122转染组细胞凋亡率明显增加;与未转染组和转染对照组比较,转染了miRNA-122的BEL-7402/5-FU细胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3前体蛋白表达降低,活化的caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表达升高。结论 miR-122能够下调BEL-7402/5-FU细胞中caspase-8、caspase-9和caspase-3前体蛋白表达,上调活化的caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表达,miR-122能促进5-FU诱导的BEL-7402/5-FU细胞凋亡。

miR-503下调Bcl-2增强BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

目的:探讨miR-503通过调控Bcl-2的表达介导肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU对5-氟尿嘧啶敏感性的影响.方法:microRNA(miRNA)芯片筛选BEL-7402与BEL-7402/5-FU细胞中表达差异的miR-503为候选的miRNA;脂质体转染法将miR-503模拟物瞬时转染至BEL-7402/5-FU细胞;实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测BEL-7402/5-FU及其亲本细胞中miR-503、Bcl-2 mRNA的表达水平;Western Blot观察肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达水平;CCK-8法检测细胞药物敏感性的改变.结果:相比于BEL-7402细胞,miR-503在BEL-7402/5-FU细胞中表达水平下调,而Bcl-2蛋白的表达水平上调;miR-503过表达后BEL-7402/5-FU细胞中的Bcl-2在mRNA和蛋白水平上表达降低;miR-503转染组的BEL-7402/5-FU细胞活力较miRNA阴性对照组显著降低.结论:miR-503可能通过下调Bcl-2的表达,进而增强BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的药物敏感性,抑制细胞增殖.

MiR-122上调野生p53蛋白增强BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶敏感性

目的探讨MiRNA-122对肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU的5-氟尿嘧啶敏感性的影响以及作用机制。方法构建miR-122及其阴性对照空载体稳定转染至BEL-7402/5-FU细胞中,Western blot检测未转染组,阴性载体转染组和miR-122转染组中与耐药相关的p53蛋白表达水平。用MTT法和流式细胞术检测三组细胞对5-氟尿嘧啶敏感性。结果 MiR-122转染组与未转染组,阴性载体转染组比较,野生型p53蛋白表达水平升高。流式细胞术检测,miR-122转染组的细胞凋亡率较未转染组和阴性载体转染组高。结论 miR-122能上调野生型p53蛋白表达,增加BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶敏感性,从而成为治疗肝癌耐药治疗的一个方法。

5-FU持续和间歇处理对Bel-7402肝癌细胞株的抑制作用

目的:评价体外5FU持续和间歇处理对Bel7402肝癌细胞株的生长抑制作用。方法:体外培养Bel7402肝癌细胞株,用一系列不同浓度的5FU对Bel7402肝癌细胞株分别进行每天24小时持续处理及2小时间歇处理,4天后进行MTT试验,检测肿瘤细胞的生长抑制率,对两组的IC50进行比较。结果:5FU处理浓度依次10.0μg/L、25.0μg/L、50.0μg/L、75.0μg/L、100.0μg/L、250.0μg/L、500.0μg/L、750.0μg/L、1000.0μg/L、2500.0μg/L、5000.0μg/L、7500.0μg/L、10000.0μg/L、20000.0μg/L持续处理组的肿瘤细胞抑制率依次分别为1.34%、2.01%、7.21%、10.37%、18.64%、29.96%、35.06%、43.35%、50.66%、87.63%、93.63%、94.46%、99.27%、99.35%,IC50是991.7μg/L。5FU处理浓度依次120.0μg/L、300.0μg/L、600.0μg/L、900.0μg/L、1200.0μg/L、3000.0μg/L、6000.0μg/L、9000.0μg/L、12000.0μg/L、18000.0μg/L、60000.0μg/L、90000.0μg/L、120000.0μg/L、240000.0μg/L2小时间歇处理组的肿瘤细胞抑制率依次分别为1.32%、1.78%、2.01%、2.89%、3.57%、5.94%、8.30%、10.36%、15.25%、17.27%、25.95%、32.63%、43.66%、67.81%,IC50为146600μg/L,为持续处理组的1478倍。

MiR-195对BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶耐药性的影响

目的探讨miR-195对BEL-7402/5-FU细胞5-氟尿嘧啶药物敏感性的影响。方法采用qRTPCR检测BEL-7402细胞与BEL-7402/5-FU细胞中miR-195的表达水平。将miR-195质粒载体瞬时转染至BEL-7402/5-FU细胞;MTT检测细胞药物敏感性的改变。结果相比于BEL-7402细胞,miR-195在BEL-7402/5-FU细胞中表达水平下调;miR-195转染组的细胞增殖抑制率较miRNA阴性对照组及未转染组明显增高。结论MiR-195能够增加BEL-7402/5-FU细胞对5-氟尿嘧啶的药物敏感性,抑制细胞增殖。

DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu增殖及机制的研究

目的检测DNA-PKcs对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu增殖的影响及其相关机制,探讨DNA-PKcs在肝癌多药耐药的发生发展中的作用。方法采用阳离子脂质体法将siDNA-PKcs转染Bel-7402/5-Fu细胞,cck-8法检测细胞增殖情况;流式细胞技术检测细胞周期;Western blot检测DNA-PKcs、TS蛋白的表达情况。结果实验组与对照组比较,细胞增殖减少(P<0.05);实验组S期细胞与对照组比较,细胞数减少(P<0.05);DNA-PKcs、TS蛋白表达结果显示,实验组相比对照组蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DNA-PKcs的表达沉默能抑制肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu的细胞增殖;其机制可能与沉默DNA-PKcs蛋白表达后,TS蛋白表达下调有关。

低浓度5-Fu24-小时持续化疗对BEL-7402肝癌细胞株的细胞周期的影响

目的研究低浓度5-Fu24-小时持续化疗和高浓度5鄄Fu短时间化疗对BEL-7402肝癌细胞株的细胞周期的影响。方法用低浓度(1000.0μg/L)的5-Fu对BEL-7402肝癌细胞株进行持续24小时的培养(A组),用高浓度(50000.0μg/L)的5-Fu对BEL-l7402肝癌细胞株进行2小时培养(B组),在培养后的不同时间点用流式细胞技术检测细胞周期的变化。结果A组结果显示:0h、4h、8h、12h、16h、20h和24h的S期细胞的百分数分别为25.23%、32.35%、39.28%、41.05%、46.02%、47.00%及47.14%。B组结果显示:0h、4h、8h、12h、16h、20h和24h的S期细胞的百分数分别为24.68%、68.43%、46.67%、43.67%、35.42%、33.22%及32.96%。结论5-Fu引起的S期细胞周期阻滞不但和浓度相关,也和作用时间相关。低浓度(1000.0μg/L)的5-Fu持续化疗较高浓度(50000.0μg/L)的5-Fu短时间(2小时)化疗更容易引起BEL-7402肝癌细胞株S期阻滞。

Artemis对人肝癌细胞系BEL-7402/5FU DNA损伤的影响

目的探讨转染sh Artemis干扰质粒对人肝癌细胞BEL-7402/5FU DNA损伤的影响。方法将人肝癌细胞分为正常对照组、脂质体对照组、空质粒对照组和转染sh Artemis干扰质粒实验组(sh Artemis实验组);建立DNA损伤模型,分别用0.625、1.25、2.5、5.0和10.0μg/m L的丝裂霉素C作用BEL-7402/5FU细胞24和48 h,MTT法检测细胞活性,Western blot观察磷酸化组蛋白H_2AX(γ-H_2AX)的表达;转染Artemis干扰质粒,检测Artemis、γ-H_2AX表达;彗星实验检测DNA的损伤。结果 0.625、1.25、2.5、5.0和10.0μg/m L的丝裂霉素C作用48h后肝癌细胞活力明显下降(P<0.05);丝裂霉素C刺激细胞48 h后,γ-H_2AX的表达量随着药物浓度的增加而增加;转染sh Artemis干扰质粒后,γ-H_2AX的表达量较正常对照组增加(P<0.05);sh Artemis实验组较正常对照组拖尾DNA量增加(P<0.05)。结论丝裂霉素C能够诱导肝癌细胞损伤;转染sh Artemis干扰质粒促进丝裂霉素C诱导的人肝癌细胞BEL-7402/5FU DNA损伤。

基因芯片分析筛选BEL-7402与BEL-7402/FU细胞中的差异miRNA表达基因

目的:探讨2种肝癌细胞BEL-7402细胞及BEL-7402/FU细胞中差异表达的miRNA并对其基因表达谱进行生物学信息分析。方法:采用TRIzol一步法提取BEL-7402细胞及BEL-7402/FU细胞的总RNA,并纯化mRNA,反转录合成荧光分子Hy3标记的cDNA探针,与基因芯片杂交;采用Genepix Pro 6.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,然后以差异为2倍的标准来确定差异表达基因。结果:在333个基因表达谱的筛选中,发现有2个基因表达水平显著上调,331个基因表达水平显著下调。结论:miR-122,miR-195等基因组对表达肝癌细胞耐药基因表达谱有显著的影响,可能参与肝癌耐药的发生、发展。

半边旗提取物5F对肝细胞癌BEL-7402生长抑制作用及增殖细胞核抗原表达的影响

目的研究半边旗提取物5F对肝细胞癌BEL-7402细胞生长的抑制作用。方法 MTT法检测5F对BEL-7402细胞的生长抑制作用;用Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测5F对细胞周期的影响;免疫细胞化学法检测5F对增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。结果 5F抑制BEL-7402细胞的生长,其效果与5F的浓度和作用时间相关,24、48和72h的IC50分别为60.33、21.32和11.22 mg/L;荧光双染色法显示经5F作用后细胞出现变形,染色质浓缩,产生凋亡小体;细胞被阻滞在G2/M,PCNA阳性表达率降低。结论 5F在体外能有效地抑制BEL-7402细胞的生长,其诱导凋亡作用可能与下调增殖细胞核抗原(PCNA)表达有关。

半边旗二萜类化合物5F下调BEL-7402细胞中PIK3CA和AKT的表达

目的：研究半边旗二萜化合物5F（简称PsL5F）对人肝癌细胞株BEL-7402中PIK3CA（Phosphoinositide-3-kinase，catalytic，alphapolypeptide）和AKT（V-akt murine thymoma viral oncogene homolog）表达的影响，探讨其抗肿瘤的可能作用机制。方法：应用肿瘤基因芯片、荧光定量实时PCR和Western blot法检测PsL5F对PIK3CA和AKT表达的影响。结果：PsL5F能明显下调肝癌细胞中PIK3CA和AKT的表达。结论：PsL5F抗肿瘤作用与PIK3CA、AKT低表达有关。

肝癌干细胞逃避5-氟尿嘧啶单药杀伤可能是造成化疗失败的重要原因

目的通过观察5-氟尿嘧啶(5-FU)处理人肝癌细胞系BEL-7402和SMMC-7721,分析细胞生物学特性的变化。方法采用Cell Counting Kit-8法检测5-FU作用前后肝癌细胞系BEL-7402和SMMC-7721增殖能力的变化;采用流式细胞法检测细胞周期组成变化和细胞群体中肿瘤干细胞标志物EpCAM、ABCG2和ICAM-1阳性细胞的比例变化。结果 10μg.ml-15-FU作用48h后,BEL-7402和SMMC-7721细胞增殖均明显受抑制(P<0.05);两细胞系实验组静息期(G0/G1期)细胞比例较对照组均明显升高(P<0.05);两细胞系中肿瘤干细胞标志物阳性细胞比例均明显升高(P<0.05)。结论肝癌细胞系BEL-7402及SMMC-7721中的肿瘤干细胞能够逃避一定剂量5-FU的杀伤作用。肝癌干细胞逃避5-FU单药杀伤可能是造成临床化疗失败的重要原因。

JNK通路介导人肝癌耐药细胞株Bel-7402/FU多药耐药的调控机制

目的:探讨C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)信号转导通路对人肝癌5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)耐药细胞系Bel-7402/FU产生多药耐药(multidrug resistance,MDR)的调控作用,为肝癌细胞MDR机制的研究提供新靶点。方法:采用蛋白质印迹法检测人肝癌亲本细胞Bel-7402和耐药细胞Bel-7402/FU中JNK及磷酸化-JNK(phospho-JNK,p-JNK)的表达;在Bel-7402/FU细胞中,使用特异性阻断剂SP600125抑制TNK通路后,采用RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测MDR1 mRNA和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达;FCM法检测罗丹明123(rhodanmine 123,Rh123)在细胞内的积聚和外排情况;MTT法检测Bel-7402/FU细胞对5-FU的敏感性。结果:耐药细胞Bel-7402/FU组与亲本细胞Bel-7402组相比,JNK蛋白的表达无明显变化,而p-JNK蛋白的表达量明显增加;抑制JNK通路后,Bel-7402/FU细胞中MDR1 mRNA表达水平和P-gP蛋白的表达水平均明显下调,Rh123的蓄积明显增加,外排明显减少,且对5-FU的敏感性明显增加。结论:JNK信号转导通路参与人肝癌耐药细胞株Bel-7402/FU中多药耐药基因MDR1和多药耐约蛋白P-gp的表达,对其耐药起调控作用。

KAI1/CD82在肠癌组织中的表达水平及表达机制

目的 初探KAI1/CD82在肠癌组织中的表达水平及可能涉及的机制。方法 采用多重逆转录聚合酶链反应 ,对 18例肠癌组织和正常肠组织中KAI1/CD 82mRNA表达水平进行半定量检测。用去甲基化试剂 5 氮脱氧胞苷作用于Bel 740 2和SMMC 772 1肝癌细胞株 ,然后检测KAI1/CD82mRNA表达水平。结果 肠癌组织中KAI1/CD82mRNA表达水平 (0 .78±0 .2 2 )较正常肠组织中表达水平 (1.5 3± 0 .12 )显著降低 (P <0 .0 5 ) ,其中 5例肠癌患者有转移 ,癌组织中KAI1/CD82mRNA表达水平 (0 .70± 0 .2 4) ,与未转移组没有显著差异。 5 氮脱氧胞苷作用下 ,SMMC 772 1细胞株中KAI1/CD82mRNA表达水平基本没变 ,而Bel 740 2细胞株KAI1/CD82mRNA表达水平有一定的增高。结论 肠癌组织中KAI1/CD82mRNA表达水平较正常肠组织中表达显著降低 ,这种表达降低可能涉及到甲基化等多种复杂调控的机制。