过表达HSPC238对Bel7402细胞周期的影响

目的:构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,研究过表达HSPC238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/HSPC238重组质粒中克隆得到HSPC238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染Bel7402细胞,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株。用RT-PCR和Western blot技术分别检测HSPC238基因在Bel7402中的mRNA和蛋白水平的表达。随后用饥饿法使各组细胞周期同步化,再用流式细胞仪分析HSPC238过表达对细胞周期的影响。结果:pcDNA3.1(-)/HSPC238经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因HSPC238的序列完全正确;RT-PCR和Western blot检测显示,与转染pcDNA3.1(-)组和未转染组相比较,转染pcDNA3.1(-)/HSPC238组的mRNA和蛋白表达水平均明显增高,但前两者间没有差异。用饥饿法同步化后,流式细胞仪检测显示过表达HSPC238可延缓Bel7402细胞株从G1期进入S期。结论:成功构建了pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,并在Bel7402中表达。初步发现过表达HSPC238可延缓肝癌细胞的细胞周期,为更进一步研究HSPC238蛋白的功能奠定了基础。

缺氧对肝癌BEL7402细胞周期及放射敏感性的影响

目的:研究肿瘤细胞在缺氧及放射情况下细胞周期的改变及细胞存活的情况。方法:将贴壁培养的肝癌细胞株BEL7402分成对照组、缺氧24h组、缺氧48h组、缺氧加照射组和单纯照射组。应用流式细胞仪检测细胞周期的改变,同时应用成克隆分析法观测细胞存活情况。结果缺氧24h与48h组的肝癌细胞株BEL7402存活分数变化不明显,加照射后的实验组则明显下降而缺氧加放射组与单纯放射组比较细胞存活分数明显升高。肝癌细胞株BEL7402细胞缺氧培养后随着缺氧时间的延长(0～48h)S期细胞逐渐减少,而凋亡细胞逐渐增多;G1期和G2/M期细胞变化不明显;单纯放射组可以看到明显的G2/M期细胞阻滞;而在缺氧加放射组看不到明显的G2/M期细胞阻滞,但凋亡细胞明显增高。结论缺氧(1%氧浓度)对肝癌细胞株BEL7402的存活无明显影响;但能保护肝癌细胞株BEL7402使其免受放射线的损伤;缺氧通过影响射线对G2/M期细胞阻滞降低了肝癌细胞株BEL7402对射线的敏感性。

白花蛇舌草对人肝癌Bel7402细胞凋亡的影响

目的从基因水平研究白花蛇舌草对体外培养的人肝癌Bel7402细胞诱导凋亡的作用及其可能的作用机制。方法采用人肝癌Bel7402细胞常规体外培养,随机设定空白对照组、5-氟尿嘧啶(5-Fu)阳性对照组、白花蛇舌草组。倒置显微镜直接观察细胞形态变化。HE染色法光镜下观察细胞形态改变,计算凋亡指数。采用MTT法检测白花蛇舌草对癌细胞的生长抑制作用。RT-PCR半定量法检测Bcl-xl、p53基因mRNA表达的变化。结果光镜下观察到白花蛇舌草组肿瘤细胞脱壁,有细胞出芽现象等凋亡形态改变;凋亡指数略低于5-Fu阳性对照组,但与空白对照组比较有显著差异(P<0.01);细胞抑制率略低于5-Fu阳性对照组,与空白对照组相比有显著差异(P<0.01);上调p53基因mRNA表达,降低Bcl-xl基因mRNA表达,与空白对照组比较均有显著差异。结论白花蛇舌草抑制人肝癌Bel7402细胞增长,诱导细胞凋亡,其分子机制可能与激活抑癌基因p53基因、抑制原癌基因Bcl-xl基因表达有关。

STAT3基因在人肝癌细胞株HepG2、Bel7402、SMMC7721和肝癌组织中的表达及意义

目的:探讨STAT3基因异常活化在人原发性肝癌发生、发展中的作用及可能的机制。方法:应用免疫组化染色法、RT-PCR和Western blotting法检测人肝癌细胞株HepG2、Bel7402、SMMC7721和肝癌组织中STAT3基因的mRNA和蛋白水平表达。结果:肝癌细胞株SMMC7721、Bel7402和HepG2中均有STAT3基因的高表达,3种肝癌细胞间表达量比较差异无显著性(P>0.05)。原发性肝癌组织和癌旁组织中均有STAT3的mRNA及蛋白水平的高表达,与正常肝组织比较差异有显著性(P<0.05),而肝癌组织与癌旁组织比较差异无显著性(P>0.05)。肝癌组织中VEGF、survivin和c-myc的mRNA表达上调,p53的mRNA表达下调。结论:STAT3的异常活化可能发生在癌变的早期,在肝癌的形成和发展中可能起重要的促进作用。

白花蛇舌草多糖对Bel7402细胞基因表达的影响

目的探讨白花蛇舌草多糖(HDP)对体外培养的人肝癌Bel7402细胞诱导凋亡的作用及可能的作用机制。方法人肝癌Bel7402细胞常规体外培养,设空白对照组、5-氟尿嘧啶(5-FU)凋亡对照组、HDP组。观察细胞形态变化,采用MTT法检测抑制率。RT-PCR法检测bcl-xl、p53基因mRNA表达的变化。结果HDP抑制人肝癌Bel7402细胞生长、促进细胞凋亡,与空白对照组相比有显著差异(P<0·01);上调p53基因mRNA表达,降低bcl-xl基因mRNA表达,与空白对照组相比有显著差异(均P<0·01)。结论HDP抑制人肝癌Bel7402细胞增长,诱导细胞凋亡,其分子机制可能与激活抑癌基因p53、抑制原癌基因bcl-xl表达有关。

小干扰RNA抑制肝癌细胞株BEL7402 ICAM-1基因表达的研究

目的研究小干扰RNA(siRNA)抑制肝癌细胞系BEL7402基因ICAM-1表达的可行性。方法根据ICAM-1基因设计shRNA片断,构建pGenesil-1/ICAM-1表达载体,转染BEL7402细胞,实时定量PCR和免疫组织化学方法检测肝癌细胞中ICAM-1基因表达抑制情况。结果该实验已成功构建了针对I-CAM-1基因的pGenesil-1/ICAM-1质粒。实时定量PCR检测结果显示,BEL7402细胞经特异性siRNA作用后ICAM-1基因的表达受抑制,其Ct值由28.8降低到21.6,免疫组织化学结果显示:RNA干扰(RNAi)能特异而有效地抑制BEL7402细胞中ICAM-1基因的表达。结论构建的pGenesil-1/ICAM-1重组质粒能有效抑制ICAM-1基因在肝癌细胞株BEL7402中的表达,为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法和材料。

六神丸对肝癌BEL7402、肺癌A549和白血病HL60的体外抗肿瘤作用

目的研究六神丸对肿瘤细胞生长的影响。方法采用MTT法,对六神丸进行体外抗肿瘤活性的研究。结果显示六神丸对人癌细胞系,白血病细胞株HL60、肝癌BEL7402H和肺癌A549均有不同程度抑制作用(P<0.01),其中高浓度组对白血病细胞株HL60、肝癌BEL7402H、肺癌A549的抑制率分别达到87.4%、91.3%、80.0%。结论六神丸在实验给药浓度下对上述3种人癌细胞的生长具有一定的抑制作用。

shRNA沉默MRE11表达对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FUDNA损伤修复的影响

目的:观察shMRE11沉默MRE11基因对肝癌耐药细胞Bel7402/5-FU DNA损伤修复功能的影响.方法:采用阳离子脂质体法将shMRE11干扰质粒转染BEL7402/5-FU细胞,Real-time PCR及Western blot检测沉默效率;Western blot检测细胞-H2AX蛋白表达;EdU法检测细胞DNA合成;MTT法检测细胞增殖情况.结果:Real-time PCR及Western blot检测结果显示MRE11 mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为78.0%、56.1%;Western blot检测-H2AX表达结果显示shMRE11实验组(1.04±0.056)较对照组(0.847±0.025)增加(P<0.05,t=10.78);EdU检测结果显示shMRE11实验组DNA合成率(38.819%±2.607%)较对照组(49.814%±1.227%)降低(P<0.05,t=-8.87);MTT细胞增殖检测结果显示转染72 h后shMRE11实验组(0.58±0.08)与对照组(0.87±0.09)相比细胞增殖速度减慢(P<0.05,t=-50.2).结论:shMRE11干扰质粒能够有效抑制B E L7402/5-F U细胞中M R E11表达,使细胞DNA损伤修复能力减弱、抑制细胞增殖.

BEL7402细胞低剂量辐射后细胞周期和相关蛋白表达的变化

目的研究低剂量辐射(LDR)对人肝癌细胞(BEL7402)增殖、细胞周期及相关信号蛋白表达的影响,为LDR临床应用提供理论依据。方法体外培养BEL7402,分为7个实验组:假辐射组(0 mGy)、5个LDR组(25,50,75,100,200 mGy)及高剂量辐射组(1 Gy)。辐射后用细胞计数法及噻唑蓝比色试验(MTT)检测细胞增殖率,用流式细胞术测定细胞周期中G0/G1,S,G2/M期的比例。应用蛋白分析系统分析检测细胞周期及相关信号蛋白共40个蛋白的表达。结果细胞计数及MTT试验,5个LDR组BEL7402细胞增殖率与假辐射组比较差异不显著(P>0.05)。流式细胞术试验,5个LDR组BEL7402细胞12、24 h G0/G1期细胞比例增高,但与假辐射组比较差异不显著(P>0.05);S期比例降低,与假辐射组比较差异显著(P<0.05);G2/M期比例升高,与假辐射组比较差异显著(P<0.05)。48 h后G0/G1,S,G2/M期与假辐射组比较差异不显著(P>0.05)。蛋白分析试验LDR后8种蛋白表达降低。结论LDR对BEL7402细胞增殖无促进作用,但在一定程度抑制增殖及细胞周期相关蛋白的表达。

半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺递送siRNA对肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中MRE11表达的影响

背景:壳聚糖是一种常用的非病毒载体,具有良好生物相容性、生物可降解性、低毒等优点,但其基因递送能力相对较弱,常需要进行结构衍生修饰。目的:观察半乳糖基化壳聚糖-聚乙烯亚胺(LA-CS-PEI)在肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中递送si RNA的能力及对减数分裂重组蛋白11(MRE11)表达的影响。方法:1将肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu或人肝细胞HL-7702分别与0,10,20,40,80,100 mg/L的LA-CS-PEI或壳聚糖-聚乙烯亚胺共培养24 h,检测细胞存活率;2将LA-CS-PEI与si RNA-FAM分别以0,2,4,8,16,32的质量比混合,制备复合转染颗粒。以复合转染颗粒转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu,48,72,96 h后,以转染效率筛选最佳质量比与转染时间,进行下步实验;3以复合转染颗粒、LA-CS-PEI、si RNA分别转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu 48 h后,以未转染的细胞为空白对照,检测MRE11基因及蛋白的表达。结果与结论:1与壳聚糖-聚乙烯亚胺相比,LA-CS-PEI毒性更低,且当LA-CS-PEI质量浓度高达100 mg/L时,仍表现出很低的细胞毒性;2LA-CS-PEI与si RNA-FAM质量比为4和8时转染效率均达95%以上,入胞效率极高,转染48 h转染效果最好,所以后续实验选择质量比为8,转染时间为48 h的复合转染颗粒;3复合转染颗粒组MRE11基因及蛋白表达低于LA-CS-PEI组、si RNA组、空白对照组(P<0.05);4结果表明,LA-CS-PEI能实现si RNA的有效递送,并能沉默肝癌耐药细胞BEL7402/5-Fu中的MRE11基因。

shMRE11质粒转染对BEL7402/5-FU肝癌细胞耐药性的影响

目的研究减数分裂重组蛋白11(MRE11)基因沉默对5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的肝癌细胞株Bel7402/5-FU的化疗敏感性及耐药相关蛋白1(MRP1)表达的影响,探讨MRE11与肝癌耐药性的关系。方法采用阳离子脂质体法将shMRE11干扰质粒转染BEL7402/5-FU细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)及Western blot法检测沉默效率;MTT法检测转染后BEL7402/5-FU细胞对化疗药物顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、5-FU的敏感性,qRT-PCR及Western blot法分别检测转染后BEL7402/5-FU细胞中耐药相关蛋白MRP1 mRNA水平及蛋白水平的变化。结果 qRT-PCR及Western blot法检测显示MRE11mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为78.0%、56.1%。MTT结果显示,shMRE11转染BEL7402/5-FU细胞后,shMRE11实验组对DDP、MMC、ADM、5-FU的IC50均低于对照组(P<0.05)。qRT-PCR及Western blot法检测结果显示shMRE11实验组MRP1mRNA及蛋白水平的表达与对照组相比均有所降低(P<0.05)。结论 shMRE11能够提高肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU对化疗药物的敏感性,降低耐药相关蛋白MRP1的表达。

肝癌细胞BEL7402中神经元特异性烯醇化酶的表达

目的:分别从转录水平、蛋白水平及细胞水平检测人神经元特异性烯醇化酶(NSE)在肝癌细胞BEL7402中的表达情况.方法:利用NSE特异引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人肝癌细胞BEL7402中扩增人NSE基因的转录产物,采用免疫印迹(Westernblot)、免疫细胞化学(ICC)染色技术检测NSE在肝癌细胞中的表达.结果:通过RT-PCR方法可以从BEL7402中扩增1305bp的NSE产物;Westernblot方法证实BEL7402细胞可以表达Mr50000的NSE蛋白;免疫细胞化学染色显示BEL7402与抗NSE单抗呈阳性反应,这说明从转录水平、蛋白水平及细胞水平均检测到了NSE在肝癌细胞BEL7402中的表达.结论:NSE可在肝癌细胞BEL7402转录和表达.

嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统对人肝癌细胞系BEL7402体外杀伤效应的研究

背景:肿瘤细胞内表达的自杀基因可将无毒性的前药转化为高毒性代谢产物以杀伤肿瘤细胞,嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统具有目前已知最强的旁观者效应,成为基因治疗领域中的研究热点。目的:研究PNP/fludarabine自杀基因系统对人肝癌细胞系BEL7402的体外杀伤效应。方法:应用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌K12菌株基因组DNA扩增PNP基因,通过8个甘氨酸的接头克隆至真核表达载体pEGFP鄄N1。将pEGFP鄄N鄄PNP以Lipofectamine2000转染BEL7402细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,命名为BEL7402/PNP。应用逆转录(RT)鄄PCR和RNA印迹法(Northernblotting)鉴定PNP基因的表达。分别应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和AnnexinV鄄FITC凋亡检测试剂盒检测PNP/fludarabine自杀基因系统对BEL7402细胞的细胞毒效应、旁观者效应和诱导凋亡作用。结果:RT鄄PCR和RNA印迹法证实转染的PNP基因能在BEL7402和BEL7402/PNP细胞中表达。低浓度fludarabine对经PNP基因转染的BEL7402细胞具有明显的细胞毒效应;旁观者效应检测显示,10%的BEL7402/PNP细胞与90%的BEL7402细胞混合,经低浓度fludarabine处理,90%的细胞可被杀死;细胞凋亡检测显示,PNP/fludarabine自杀基因系统对BEL7402细胞具有明显的诱导凋亡作用。结论:PNP/

shRNA沉默DNA-PKcs表达对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的影响

目的观察shDNA-PKcs沉默DNA-PKcs基因对肝癌耐药细胞Bel7402/5-FU耐药性的影响。方法采用双酶切、测序分析鉴定shDNA-PKcs干扰质粒;用阳离子脂质体法将shDNA-PKcs质粒转染BEL7402/5-FU细胞,根据荧光细胞数计算转染率,Real-time PCR及Western blot检测沉默效率;MTT法检测细胞药物敏感性;Real-time PCR和Western blot检测P-gp mRNA和蛋白表达。结果双酶切鉴定结果显示质粒约为6300bp,测序结果显示插入序列为shDNA-PKcs序列。荧光细胞计数显示质粒的转染率为62.2%。Real time PCR及Western blot检测结果显示DNA-PKcs mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为82.6%、71.8%;MTT检测结果显示shDNA-PKcs实验组的ADM和5-FU的IC50值比对照组ADM、5-FU低(P<0.05),DDP和MMC的IC50值与对照组比无统计学意义(P>0.05)。Real time PCR和Western blot检测结果显示实验组P-gp mRNA、蛋白表达水平均比对照组低(P<0.01)。结论 shDNA-PKcs干扰质粒能够有效抑制BEL7402/5-FU细胞中DNA-PKcs表达,增加细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能与P-gp蛋白的下调有关。

3种抗肝癌药物单用和联用对人肝癌细胞BEL7402和人正常肝细胞增殖的抑制作用

目的:观察DDP、5-Fu、EADM在单用、两两联用和3药联用时对人肝癌细胞株BEL7402和人肝细胞增殖的抑制作用。方法:MTT法测定3种药物对人肝癌细胞株BEL7402和人肝细胞增殖的抑制率,绘制生长曲线。结果:单用时3种药对BEL7402的抑制率分别为49.55%、31.46%、39.87%;对肝细胞的抑制率分别为27.32%、19.66%、21.58%;DDP+5-Fu对BEL7402的抑制率为72.39%,对肝细胞的抑制率为34.89%;DDP+EADM对BEL7402的抑制率为56.42%,对肝细胞的抑制率为32.46%;5-Fu+EADM对BEL7402的抑制率为67.92%,对肝细胞的抑制率为37.12%;3药联用对BEL7402的抑制率为86.93%,对肝细胞的抑制率为41.69%。结论:3种药物单药、两两联用和3药联用均对人肝癌细胞株BEL7402有明显的增殖抑制作用,同时可抑制人肝细胞的增殖。

健脾化瘀复方药物血清对人肝癌细胞BEL7402增殖的影响

目的:观察健脾化瘀复方药物血清对人肝癌BEL7402细胞增殖的抑制作用。方法:人(健康志愿者)口服不同剂量健脾化瘀复方(0.83m l/kg、1.67m l/kg、2.5m l/kg),分离血清,得到含有健脾化瘀复方有效作用成分的含药血清,处理体外培养的人肝癌BEL7402细胞,MTT法检测细胞增殖。结果:与含小牛血清的RPM I-1640培养液比较,以含10%健康人血清的RPM I-1640培养液培养人肝癌BEL7402细胞,与小牛血清一样,20%血清组,BEL7402细胞增殖能力最强(P<0.01)。人服用不同剂量的健脾化瘀复方1小时后采集的血清对人肝癌BEL7402细胞增殖具有抑制作用,剂量为1.67m l/kg时,增殖抑制率30.0%,剂量为2.50m l/kg时,增殖抑制率为36.1%,抑制作用呈剂量依赖性。结论:健脾化瘀复方药物血清对人肝癌BEL7402细胞具有显著增殖抑制作用。

bcl-xl和p53在人肝癌Bel7402细胞中的表达及中药的干预作用

目的:从基因水平探讨白花蛇舌草多糖对体外培养的人肝癌Bel7402细胞凋亡诱导的作用及机制。方法:水提醇沉法提取白花蛇舌草多糖,人肝癌Bel7402细胞常规体外细胞培养,设定空白对照组、5-氟尿嘧啶阳性对照组、白花蛇舌草多糖组。HE染色法光镜下观察细胞形态改变,计算凋亡指数,采用MTT法检测白花蛇舌草多糖对癌细胞的生长抑制作用,RT-PCR法检测原癌基因bc l-xl、抑癌基因p53基因mRNA表达的变化。结果:白花蛇舌草多糖体外抑制人肝癌Bel7402细胞生长、促进细胞凋亡,凋亡指数达16.97(,以MTT显色法检测细胞抑制率达到61.5(,以RT-PCR半定量法检测,上调p53基因mRNA表达,降低bc l-xl基因mRNA表达,以上各指标与空白对照组相比均有显著差异。结论:白花蛇舌草多糖抑制人肝癌Bel7402细胞增长,诱导细胞凋亡,其分子机制可能与激活抑癌基因p53基因、抑制原癌基因bc l-xl基因表达有关。

甲胎蛋白促人肝癌Bel7402细胞增殖的机制研究

目的:观察甲胎蛋白促肿瘤细胞增殖的信号转导方式。方法:用从人脐带血清中提取的甲胎蛋白,作用于体外培养的人肝癌Bel7402细胞,运用MTT染色计数法,流式细胞仪测定细胞周期和3H-脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)参入法等指标检测细胞增殖状况;放射受体分析细胞膜上甲胎蛋白受体存在和数目;免疫结合法检测细胞内cAMP浓度;Westernblot分析P21ras蛋白的表达。结果:甲胎蛋白(10～80mg·L-1)作用24h后,人肝癌Bel7402细胞有不同程度的促增殖作用;在人肝癌Bel7402细胞膜上存在2种不同的解离平衡常数(Kd)的甲胎蛋白受体,Kd分别为Kd1=1.3×10-9mol·L-1(89400位点/细胞)和Kd2=9.9×10-8mol·L-1(582000位点/细胞)。AFP能显著提高Bel7402细胞内的cAMP浓度,对P21ras的表达也有明显的促进作用。甲胎蛋白的单克隆抗体能阻断这种作用。结论:甲胎蛋白具有促人肝癌Bel7402细胞增殖的作用,这种作用是由受体介导的cAMP信号转导途径实现的。

甲胎蛋白对NIH3T3细胞和人肝癌Bel7402细胞增殖的促进作用

目的:观察甲胎蛋白对细胞增殖的影响。方法:用从人脐带血清中提取的甲胎蛋白,作用于体外培养的NIH3T3细胞和人肝癌Bel7402细胞,运用MTT染色计数法,细胞周期时相测定和3H脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)参入法等指标检测细胞增殖状况。结果:甲胎蛋白(10～80mg·L-1)作用24h后,对NIH3T3细胞、人肝癌Bel7402细胞均有不同程度的促增殖作用,甲胎蛋白的单克隆抗体能阻断这种作用。结论:甲胎蛋白是促进某些新生细胞或肿瘤细胞增殖的内源性物质。