通过构建烟曲霉bem46过表达菌株研究其在极性生长中的作用

目的构建烟曲霉bem46基因过表达株,探究bem46基因过表达情况下对烟曲霉极性生长及与其他极性基因的相互作用关系。方法原生质体法构建烟曲霉bem46过表达株;激光共聚焦显微镜观察烟曲霉bem46过表达时的绿色荧光定位;观察记录烟曲霉Ku80、烟曲霉bem46基因缺陷株(Δbem46)和烟曲霉bem46过表达株的发芽率;记录烟曲霉Ku80、Δbem46和过表达株菌落径向生长情况;光学显微镜下观察乳酸酚棉蓝染色的烟曲霉bem46过表达菌落生长情况;实时荧光定量PCR方法测定烟曲霉Ku80、Δbem46和过表达株中有关极性生长的基因的相对表达量。结果利用原生质体法成功构建烟曲霉bem46的过表达株;激光共聚焦显微镜观察到bem46过表达时绿色荧光大量聚集在孢子头部位,而菌丝中几乎无荧光显示;相比于Ku80正常状态的发芽情况,bem46过表达株的发芽时间提前,而Δbem46株的发芽时间滞后;Ku80株、Δbem46和过表达株的径向生长差异无统计学意义;经过乳酸酚棉蓝染色以及显微镜下的观察,发现Ku80株、Δbem46和过表达株的孢子头形态有明显的差异,bem46过表达时可明显刺激孢子头膨大;通过测定烟曲霉Δbem46和bem46过表达株中极性生长基因的相对表达量,发现不论bem46基因在烟曲霉中缺失还是过表达,烟曲霉中cdc24、bem1、bem3、bud5、rsr1以及rasb基因的相对表达量均明显降低,cdc24表达量变化不大。结论bem46基因可以促进烟曲霉孢子萌发,影响烟曲霉极性生长过程中的孢子和菌丝形态;在相关基因的信号转导通路中,bem46基因可能参与cdc 42有关的极性生长信号转导通路。

烟曲霉Bem46基因敲除株构建及其功能初步研究

目的构建烟曲霉Bem46基因敲除株,初步明确Bem46基因在烟曲霉生长出芽和各种压力传导中的作用,以及对细胞壁形成的影响。方法采用生物信息学方法查找烟曲霉中Bem46基因,设计引物,并以pyrG作为筛选标记构建烟曲霉Bem46基因敲除株(ΔBem46)。观察含不同压力物质培养基上对照菌株和ΔBem46径向生长速度,观察两菌株发芽状况以及在含有细胞壁抑制剂培养基上的生长状况。结果通过序列比对在烟曲霉基因组中找到了Bem46基因,其编号为Afu7g04660,由1 116bp碱基组成,编码311个氨基酸。使用原生质体法得到烟曲霉ΔBem46并经PCR和Southernblot确认。经观察在含有山梨醇作为渗透压力来源的培养基上ΔBem46生长明显较对照菌株快。显微镜下观察到在GMM液体培养基中,ΔBem46发芽速度慢于对照株。结论烟曲霉Bem46基因涉及由山梨醇引起的渗透压压力传导,并且该基因对促进孢子发芽可能有作用。

烟曲霉Bem46基因荧光定位菌株构建及对极性生长相关基因影响作用初探

目的构建以eGFP作为荧光标记的烟曲霉Bem 46基因定位菌株,观察其在烟曲霉不同形态中的定位情况,初步明确该基因对极性生长相关基因Bem1、Bud5表达的影响。方法运用分子生物学方法将烟曲霉Bem46基因克隆入质粒pUCGH,构建荧光定位载体。原生质体法转化烟曲霉获得该基因定位菌株并验证。激光共聚焦显微镜观察绿色荧光在烟曲霉孢子、芽管以及菌丝状态下分布情况。RT-PCR观察对照菌株Ku80和ΔBem46中极性生长相关基因Bem1、Bud5的表达量。结果通过全基因克隆成功获得烟曲霉Bem46基因定位菌株并经PCR验证。激光共聚焦显微镜下绿色荧光在孢子中弥散分布,在孢子即将发芽时荧光在孢子一侧聚集,并随着芽管形成,荧光在极性生长的一侧延伸分布于整个菌丝中,在菌丝形成侧枝膨大处可见荧光明显聚集。RT-PCR结果表明ΔBem46中基因Bem1、Bud5表达量均较对照菌株有所下降。结论烟曲霉Bem46基因可能同孢子发芽、菌丝发生侧枝的极性生长相关;且该基因缺陷可影响极性生长相关基因Bem1、Bud5表达。