小檗皮总生物碱的提取纯化、含量测定和急性毒性实验研究

目的:对小檗皮总生物碱进行提取纯化和含量测定,并探讨其对小鼠的急性毒性反应。方法:采用加热回流和大孔吸附树脂提取纯化小檗皮药材中的总生物碱部位。以盐酸小檗碱为对照品,采用酸性染料比色法对提取物中的总生物碱含量进行测定。采用单次给药小檗皮总生物碱提取物,观察小鼠的活动、体质量、死亡等情况;采用加权回归法计算半数致死量(median lethal dose,LD50)及95%置信区间。结果:小檗皮提取物中总生物碱的平均含量为56.84%,其对小鼠的LD50为2.34 g·kg^(-1)(95%置信区间为2.072~2.637 g·kg^(-1)),为临床用量的272.6倍;最大非致死剂量为1.32 g·kg^(-1),为临床用量的153.8倍。结论:小檗皮总生物碱提取物在临床剂量范围内使用安全可靠,为其开发利用提供了科学依据。

藏药小檗皮的醇提工艺优化研究

目的:优化小檗皮的醇提工艺。方法:以小檗皮中木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量和浸膏量为评价指标,采用均匀设计-综合评分法考察乙醇用量、乙醇体积分数、提取时间对提取工艺的影响;采用3次均匀设计试验分别对第1次、第2次、第3次的提取工艺进行考察,分别确定3次提取试验各自的优化工艺并进行验证试验,计算转移率。结果:最优工艺为取小檗皮粗粉加入15倍量75%乙醇,回流提取2次,每次提取120 min。验证试验中,小檗皮按优化工艺提取2次后木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量分别为58.96、4.82、3.07、23.29 mg/g,转移率分别为93.85%、95.02%、96.28%、94.88%(RSD分别为3.87%、2.64%、4.00%、3.91%,n=3)。结论:优化的小檗皮乙醇回流提取工艺合理、可行,稳定性好。

小檗皮水浸膏对db/db糖尿病小鼠视网膜病变的影响(Ⅱ)

目的:观察小檗皮浸膏对基因突变自然发病型db/db糖尿病小鼠视网膜蛋白激酶C-β(PKC-β),缺氧诱导因子-1α(HIF-1α),血管内皮细胞生长因子(VEGF)的影响,探索该药防治糖尿病视网膜病变的作用机制。方法:选用18周龄db/db糖尿病小鼠,db/m型同性同窝瘦型小鼠为对照。采用随机方法将db/db小鼠分为db/db组,小檗皮高、中、低剂量组(1.50,0.75,0.38 g·kg^(-1)),羟苯磺酸钙组(0.23 g·kg^(-1)),盐酸小檗碱组(0.135 g·kg^(-1))。相关药物连续ig 2个月,并于ig 2个月末处死小鼠。采用免疫组化方法观察3种因子在视网膜结构的表达情况,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测视网膜内3种因子的基因与蛋白表达。结果:与db/m组比较,db/db组视网膜组织PKC-β,VEGF免疫组化反应呈阳性,表达显著增加(P<0.01);HIF-1α免疫组化反应呈阳性,表达量有升高趋势,但差异无统计学意义;db/db组三种因子的基因与蛋白表达显著增加(P<0.01)。与db/db组比较,羟苯磺酸钙组视网膜组织PKC-β免疫组化反应呈阳性,表达显著降低(P<0.05),小檗皮高剂量组视网膜组织PKC-β免疫组化反应呈阳性,表达显著降低(P<0.01),其他各给药组较db/db组PKC-β表达有降低趋势,但差异无统计学意义;各给药组视网膜组织HIF-1α免疫组化反应呈阳性,表达有降低趋势,但差异无统计学意义;小檗碱组、小檗皮低剂量组视网膜组织VEGF免疫组化反应呈阳性,表达明显降低(P<0.01),其他各给药组视网膜组织VEGF有降低趋势,但差异无统计学意义。与db/db组比较,羟苯磺酸钙组HIF-1α基因表达明显降低(P<0.05),其他各给药组PKC-β,HIF-1α,VEGF基因表达有降低趋势,但差异无统计学意义。与db/db组比较,羟苯磺酸钙组、盐酸小檗碱组、小檗皮高、低剂量组PKC-β蛋白表达显著降低(P<0.01),小檗皮中剂量组PKC-β蛋白表达有降低趋势,但差异无统计学意义;羟苯磺酸钙组、盐酸小檗碱组、小檗皮高、中剂量组HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01),小檗皮低剂量组HIF-1α蛋白表达量有降低趋势,但差异无统计学意义;各给药组VEGF蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:小檗皮浸膏防治db/db糖尿病小鼠视网膜病变的作用机制可能与抑制PKC-β,HIF-1α,VEGF表达有关。

基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代谢组学技术筛选不同基原小檗皮品种鉴别的指标性成分

目的 研究不同基原小檗皮药材(甘肃小檗Berberidis kansuensis Schneid.、鲜黄小檗B.diaphana Maxim.、匙叶小檗B.vernae Schneid.和刺红珠B.dictyophylla Franch.)的整体化学成分差异,筛选品种鉴别的指标性成分。方法 采用超高效液相色谱-串联四级杆静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-ExactiveOrbitrapMS)代谢组学技术,分析不同基原小檗皮药材的整体化学成分,结合主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least-squares discrimination analysis,PLS-DA)和方差分析筛选不同基原鉴别的化学标志物。结果 共鉴定了47个化学成分,包括24个生物碱类、12个有机酸类及其衍生物、5个糖类及其衍生物,以及6个其他类成分。筛选出药根碱、四氢巴马汀、蟾毒色胺内盐等12个化学标志物。结论 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS代谢组学技术结合化学计量学方法,可有效阐明小檗皮不同基原药材的化学成分差异,为其品种鉴别和质量控制提供了参考依据。

小檗皮总生物碱提取物的大孔树脂纯化工艺与质量标准考察

目的:优选小檗皮总生物碱提取物的大孔树脂纯化工艺,并建立其质量标准,为该有效部位的制剂开发提供参考。方法:采用酸性染料比色法考察小檗皮总生物碱提取物的纯化工艺,考察的工艺参数包括上样液质量浓度、上样速度、树脂柱径高比、水洗用量、洗脱剂体积分数及用量、洗脱流速等。采用HPLC测定小檗皮总生物碱提取物中4种生物碱类成分(木兰花碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱)的含量,流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱,检测波长270 nm,确定最佳纯化工艺。按2015年版《中国药典》的要求进行小檗皮总生物碱纯化物的薄层色谱鉴别、含量测定、特征图谱等质量标准研究。结果:小檗皮总生物碱提取物的最佳纯化条件为采用HPD100型大孔树脂10 g,树脂柱径高比1∶8,上样液质量浓度11 g·L^-1,上样液体积50 mL,上样流速1 mL·min^-1,加4 BV水洗脱(1 BV=15 mL),加30%乙醇9 BV洗脱;纯化后小檗皮总生物碱的转移率>80%,纯度>65%。建立了小檗皮总生物碱纯化物的质量标准,特征图谱中共有峰有19个,整体相似度均>0.99。结论:优选的纯化工艺稳定可行,建立的质量标准可靠,适用于小檗皮总生物碱提取物的纯化及质量控制。