BET蛋白功能及其抑制剂研究进展

对于肿瘤表观遗传学的研究一直是抗肿瘤治疗的热点话题。BET家族含有溴结构域,通过识别乙酰化组蛋白并将转录因子和转录延伸复合物募集到染色质上,从而促进RNA聚合酶II的磷酸化和随后的转录起始和延伸,进而影响染色质重塑。近年来一些BET抑制剂已投入相关临床试验研究中,为不同肿瘤的治疗带来新的希望。本文结合BET蛋白的结构阐明其在相关疾病发生发展中的重要作用,并介绍其抑制剂目前的发展状况及应用前景。

BET蛋白抑制剂JQ1对MRL/lpr狼疮小鼠外周B细胞分化的影响

目的:探讨BET蛋白抑制剂JQ1对MRL/lpr狼疮小鼠外周B细胞分化的影响及其治疗作用。方法:12周龄MRL/lpr小鼠分别腹腔注射JQ150 mg/(kg·d)或10%DMSO;每2周检测24 h尿蛋白定量;6周后检测血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、补体C3、补体C4、抗ds-DNA抗体、ANA及IgG、IgG1、IgG2a、IgM等免疫球蛋白水平;PAS染色观察肾脏组织病理学改变,免疫荧光染色观察IgG和C3免疫复合物沉积情况。利用流式细胞术检测小鼠B细胞各亚群细胞的比例;RT-qPCR检测脾脏prdm1 mRNA表达水平。结果:与DMSO组相比,JQ1治疗组小鼠24 h尿蛋白定量显著减少,血清BUN、Cr水平明显降低,补体C3、C4水平明显升高,抗ds-DNA抗体、ANA以及IgG、IgG1、IgG2a和IgM等免疫球蛋白水平明显降低;此外,JQ1治疗组小鼠肾小球、肾血管的病理损害程度均明显减轻,肾脏IgG和C3免疫复合物沉积显著减少。同时,JQ1治疗组小鼠脾脏、淋巴结、外周血B细胞中浆细胞和记忆B细胞亚群的比例显著下降;JQ1治疗亦显著抑制狼疮小鼠B细胞内调节浆细胞分化的关键转录因子prdm1 mRNA表达。结论:BET蛋白抑制剂JQ1对MRL/lpr狼疮小鼠具有显著的治疗作用,通过抑制Blimp1表达进而调节浆细胞分化可能是其发挥治疗作用的机制之一。BET蛋白可能是SLE治疗的新靶标。

BET蛋白与脑认知功能关系的研究进展

溴结构域和超末端结构域(BET)蛋白能识别乙酰化组蛋白并与之结合,同时与染色质调节因子相互作用或招募转录起始复合物,从而启动基因转录。近几年,BET蛋白抑制剂的合成推进了BET蛋白相关表观遗传学研究。本文综述BET蛋白的结构和功能、BET蛋白抑制剂、BET蛋白在学习和记忆中的作用、BET蛋白在老年痴呆症中的作用以及BET蛋白在药物成瘾中的作用。

表观“阅读器”BET蛋白家族对哺乳动物发育和iPSC重编程的调控

溴结构域和超末端结构域(bromodomain and extra-terminal,BET)蛋白家族作为表观"阅读器",在哺乳动物发育过程中起着至关重要的作用。其家族内的各成员通过识别各种表观修饰并募集相应的功能复合物,对相关基因进行精密调控,促使早期胚胎向特定方向分化和发育。另外,随着诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)重编程技术发展,越来越多的研究发现BET蛋白家族在体细胞重编程中可能也占据着核心地位。本文总结了BET蛋白家族在哺乳动物发育和iPSC重编程中的作用,并对BET家族调控重编程的新机制进行了展望。

BET蛋白抑制剂JQ1对脑缺血再灌注损伤的作用

目的探讨表观遗传学信号分子BET蛋白的抑制剂JQ1对脑缺血再灌注损伤的保护作用和机制。方法选择成年雄性Wistar大鼠55只,并随机分为对照组、模型组和实验组,利用线栓法制造大鼠脑缺血再灌注损伤模型。实验组在造模的同时给予JQ1干预。24 h后处死所有实验动物,并通过Zea-Longa神经行为学评分、TTC染色、HE染色、ELISA法等方法,检测大鼠的神经功能、脑梗死体积、脑组织病理学改变、变性细胞指数(DCI)以及脑组织炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)]的水平。结果模型组和实验组大鼠的神经行为学评分较对照组均明显增高(P<0.05),但实验组大鼠的神经行为学评分较模型组明显下降(P<0.05);模型组大鼠的脑梗死体积、DCI明显高于对照组(P<0.05);当给予JQ1干预后,虽然实验组大鼠脑梗死体积、DCI仍然高于对照组(P<0.05),但是较模型组已明显下降(P<0.05);模型组大鼠脑组织的炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平明显高于对照组(P<0.05);当给予JQ1干预后,虽然实验组大鼠脑组织的炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的水平仍然高于对照组(P<0.05),但较模型组已明显下降(P<0.05)。结论 BET蛋白的抑制剂JQ1对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其机制可能与JQ1具有抑制炎症因子表达的作用有关。

抑制BET蛋白对水牛支持细胞自噬的影响

旨在探究抑制水牛BET(bromodomain and extra terminal,BET)蛋白对支持细胞自噬调控的影响。以水牛支持细胞(sertoli cells,SCs)为研究对象,首先从睾丸中分离纯化得到高纯度的SCs,通过免疫荧光法及RT-PCR法检测出水牛SCs的标记基因均正常表达。结果显示,BET蛋白被抑制后,水牛SCs形态和数量发生显著变化,细胞的体积变大,数量减少,折光性减弱,免疫荧光分析和MDC分析也证实其生物学功能受到影响。超微结构分析发现,水牛SCs中产生大量自噬体、自噬溶酶体以及自噬空泡,且自噬相关标记基因的表达量显著提升。说明抑制BET蛋白可引起水牛SCs活性和自噬活性降低,并导致自噬体增多。结果表明,本试验为BET蛋白调控雄性生殖机制的研究提供了依据。

BET蛋白通过调控NF-κB通路参与炎症基因转录

目的:探讨特异性抑制溴结构域(bromodomain and extra-terminal,BET)蛋白对血管内皮细胞激活与早期动脉粥样硬化形成的作用及其分子机制。方法:1.原代分离培养脐静脉内皮细胞和小鼠心脏血管内皮细胞后用肿瘤坏死因α(TNFα)刺激模拟炎症过程,以小分子化合物JQ1特异性抑制BET蛋白,分组如下:(1)对照组;(2)TNFα(25 ng/m L)处理组;(3)TNFα+JQ1处理组。采用Realtime-PCR及流式细胞术检测各组细胞炎症因子m RNA及蛋白水平的表达,采用5XκB荧光素酶报告基因检测各组核转录因子kappa B(NF-κB)转录活性。2.LDL受体基因敲除(LDLR-/-)小鼠随机分为2组:JQ1组(n=8,JQ1腹腔注射,50 mg/kg,每天一次)和对照组(n=8,DMSO溶媒组),同时给予高胆固醇饮食8周,采用免疫组化方法检测主动脉弓部血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达水平。结果:与对照组相比,TNFα组炎症因子m RNA、蛋白表达明显上调(P<0.01),使用JQ1干预后,炎症因子E选择素(E-selectin)、P选择素(P-selectin)、VCAM-1及白细胞介素-8(IL-8)m RNA及蛋白表达均明显下调(P<0.01)。LDLR-/-小鼠高脂饮食诱导8周后JQ1显著下调了主动脉弓部VCAM-1蛋白表达。5XκB荧光素酶报告基因结果显示,与TNFα(-)相比,TNFα(+)组荧光素酶报告基因活性增强,JQ1可以显著下调报告基因活性(P<0.01)。结论:BET蛋白通过调控NF-κB信号通路参与了血管内皮炎症基因转录;抑制BET蛋白下调了NF-κB目的基因表达从而减轻了内皮激活及高脂诱导的早期动脉粥样硬化病理改变。

雷公藤甲素联合BET蛋白抑制剂JQ1对MLL基因重排阳性急性髓系白血病细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的探讨雷公藤甲素(TPL)联合BET蛋白抑制剂JQ1对MLL基因重排阳性急性髓系白血病(AML)细胞株MV4-11的增殖抑制及凋亡诱导作用,并探讨其协同作用机制。方法取对数生长期MV4-11细胞,分别接受不同浓度(100、200、300、400 nmol/L)JQ1单药、4 nmol/L TPL单药或4 nmol/L TPL联合上述不同浓度JQ1处理48 h后,采用CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡情况,JC-1法检测线粒体膜电位变化,蛋白质印迹法检测线粒体凋亡通路相关蛋白表达变化。结果JQ1单药作用MV4-11细胞48 h半数抑制浓度(IC50)值为(283.9±10.7)nmol/L,而4 nmol/L TPL能增强JQ1对MV4-11细胞的增殖抑制作用,联合用药IC50值降低至(148.1±2.6)nmol/L,差异有统计学意义(t=25.31,P=0.029)。FCM检测细胞凋亡结果显示,4 nmol/L TPL联合不同浓度(100、200、300、400 nmol/L)JQ1作用MV4-11细胞48 h后,细胞凋亡率分别为(16.4±1.9)%、(27.5±2.1)%、(32.9±3.6)%、(35.5±3.0)%,与JQ1单药组[(9.6±2.3)%、(12.6±1.4)%、(19.5±3.3)%、(22.7±2.1)%]相比,差异有统计学意义(F=9.25,P<0.01)。4 nmol/L TPL联合JQ1作用MV4-11细胞12 h后,细胞膜电位水平低于JQ1单药组,差异有统计学意义(P<0.05)。4 nmol/L TPL联合JQ1作用MV4-11细胞24 h后,抗凋亡蛋白bcl-2、Mcl-1水平下降,而促凋亡蛋白bax水平上升。结论TPL可增强BET蛋白抑制剂JQ1对MLL基因重排阳性AML细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用,其机制可能与增强线粒体凋亡途径相关。

原型泡沫病毒Bet蛋白与SUMO1的相互作用及功能初探

原型泡沫病毒(prototype foamy virus,PFV)属于反转录病毒科泡沫病毒亚科,Bet是其编码的1个非结构蛋白.研究表明Bet蛋白在调控病毒蛋白的表达及病毒释放等过程中发挥重要作用.为进一步探究Bet的其他功能,通过酵母双杂交实验,以Bet作为诱饵钓取到与之相互作用的蛋白SUMO1,并初步探究了Bet对SUMO1功能的影响.实验结果表明,Bet与SUMO1在真核细胞中存在相互作用;Bet能够影响SUMO1在细胞中的定位,进而影响核定位蛋白NS1mut的SUMO化修饰.

自制显示系统检测免疫印迹中的目的蛋白

目前蛋白免疫印迹显示系统有显色法和化学发光法，因化学发光法具有灵敏、快速、准确等特点而倍受科研工作者的青睐，但一般商品化的化学发光试剂盒价格颇为昂贵，为此，在参考文献的基础上作了一些改进，将Tris-CI的pH值从7．5提高到11．0，同时提高了对碘苯酚的浓度（从1mmol／L提高到2mmol／L），得到了自制的化学发光试剂。首先用其检测了大肠杆茵中表达的2种不同分子量的蛋白（gam，13kDa；bet，30kDa），发现当蛋白上样量为2～20ng时，各蛋白条带均清晰显示。随后的斑点免疫印迹实验表明：自制及进口化学发光试剂在检测酶标二抗效价方面有着同样高的敏感性。

鸡BET家族蛋白的亚细胞定位及其基因在免疫器官中的表达特征分析

为了明确鸡(Gallus gallus)溴结构域和超末端结构(bromodomain and extra terminal,BET)家族蛋白亚细胞定位及其基因在免疫器官中的表达特性,并为后续研究BET家族蛋白调控鸡相关病毒复制的作用机制提供基础,本研究将前期构建的鸡BRD2、BRD3、BRD4基因重组真核表达载体pEGFP-BRD2、pEGFP-BRD3和pEGFP-BRD4分别转染人(Homo sapiens)胚胎肾细胞(HEK-293T),利用Western blotting和荧光检测鸡BRD2、BRD3、BRD4基因的表达和蛋白的亚细胞定位情况,并利用实时定量PCR(real time quantitative PCR)技术检测1~6月龄鸡免疫器官中BRD2、BRD3和BRD4基因的表达。结果表明,鸡BET家族蛋白融合蛋白EGFP-BRD2、EGFP-BRD3和EGFP-BRD4在细胞中正确表达,且鸡BRD2、BRD3和BRD4蛋白主要定位在细胞核。实时定量PCR检测结果发现,鸡的脾脏和胸腺中BRD2基因的表达量在3月龄时最高,在法氏囊中则在4月龄时最高,表达变化均为“倒V”型;脾脏中BRD3基因的表达量在1月龄时为最高;而鸡的胸腺和法氏囊中,BRD3和BRD4基因的表达量均在6月龄时为最高,其中,BRD3基因在胸腺和法氏囊的表达变化,以及BRD4基因在法氏囊中的表达变化均为逐渐上升的“直线”型;BRD3基因在脾脏中的表达变化,以及BRD4基因在胸腺中的表达变化均为“倒N”型;脾脏中BRD4基因的表达量在3月龄时最高,其表达变化呈先上升后下降的趋势。鸡BET家族基因在不同月龄鸡的脾脏、胸腺和法氏囊中均有表达,但表达量呈现不同的变化趋势,BET家族蛋白主要定位在细胞核。

JQ-1损伤小鼠遥远线索性恐惧消退过程中前扣带回皮质区的结构可塑性

目的:探讨溴结构域和超末端结构域(BET)蛋白抑制剂JQ-1对小鼠遥远线索性恐惧消退过程中前扣带回皮质(ACC)区神经结构可塑性的影响。方法:将小鼠分为两组:JQ-1组和溶媒组。对小鼠进行5次声音和足底电击配对训练,建立线索性恐惧条件化模型。恐惧条件化前连续5 d进行JQ-1或溶媒的注射,每天1次,共5次。恐惧条件化后14 d进行消退训练,消退训练后3 h取材,通过高尔基染色方法观察树突分支数和树突棘密度,通过透射电镜技术观察ACC区突触变化。结果:在行为训练阶段,JQ-1组和溶媒组小鼠获得同等程度的恐惧条件化,且在遥远恐惧消退训练阶段无明显行为学差异。遥远恐惧消退训练后3 h取材,高尔基染色结果显示,JQ-1组小鼠ACC区锥体神经元顶树突分支数明显少于溶媒组(P<0.05);顶树突树突棘密度明显低于溶媒组(P<0.05)。透射电镜方法结果显示,与溶媒组相比,JQ-1组小鼠ACC区突触密度显著降低(P<0.05)。结论:恐惧条件化前注射JQ-1使ACC区参与遥远恐惧消退的神经元结构可塑性降低。

JQ1对系统性红斑狼疮患者CD4^+T细胞中自身免疫相关基因表达的作用

目的:探讨溴结构域(bromodomain and extra-terminal,BET)蛋白抑制剂JQ1对系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)外周血CD4^+T细胞中自身免疫相关基因表达的作用。方法:利用磁珠分选获得SLE患者CD4^+T细胞,采用流式细胞检测CD4^+T细胞纯度。用JQ1(100 nm/L)处理CD4^+T细胞6,24,48 h后收集细胞。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)检测不同辅助性T细胞亚类特异性基因的m RNA表达。采用ELISA法检测细胞培养上清中细胞因子的蛋白水平。结果:磁珠分选所得CD4^+T细胞百分比为97.2%。与对照组相比,JQ1处理组IFNG,IL-17F,IL-21,CXCR5和FOXP3 m RNA表达水平在6,24,48 h均显著降低(P<0.05),IL-17A m RNA表达在6,24 h显著下降(P<0.01),IL-4 m RNA表达在24,48 h显著升高(P<0.01),TGF-β1 m RNA表达在6,48 h显著升高(P<0.05)。JQ1处理48 h细胞培养上清中IFN-γ,IL-21和IL-17蛋白水平明显下降(P<0.05),IL-4和TGF-β蛋白水平明显升高(P<0.05)。结论:BET蛋白抑制剂JQ1可纠正SLE患者CD4^+T细胞中的免疫调节失衡,促进免疫稳态恢复。