牛结核分枝杆菌BfrB蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

目的旨在预测和分析牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BfrB蛋白的结构和潜在功能,并进行克隆表达及多克隆抗体的制备,为新型疫苗、诊断靶点等的开发提供理论基础。方法利用生物信息学软件预测分析BfrB蛋白的生物信息学特征,克隆其编码基因并与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体并利用IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化重组BfrB蛋白,SDS-PAGE和Western blot验证分析重组BfrB蛋白,以该蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并测定其效价。结果BfrB蛋白含有181个氨基酸,分子式为C_(903)H_(1405)N_(255)O_(276)S_(6),理论分子质量为20.442 ku,无信号肽和跨膜结构域,是一种定位于细胞质的亲水性的储铁蛋白。该蛋白有3个固定无序结构域、15个磷酸化位点、16个甲基化位点和2个乙酰化位点,无糖基化位点。其二级结构中α-螺旋占70.01%,延伸链占4.42%,β-折角占3.87%,无规则卷曲占21.55%,三级结构与二级结构预测结果一致,空间结构(四级结构)为24个亚单位(三级结构)组成的聚合物。BfrB蛋白含有9个B细胞抗原表位、7个CD4+T细胞抗原表位和3个CD8+T细胞表位。该蛋白与牛结核分枝杆菌BCG、结核分枝杆菌H37Rv等的BfrB蛋白亲缘关系较近,同源性高达99%以上。与BfrB蛋白存在相互作用的蛋白有Oxidase、rpsL、katG、hemH等,其中BfrB蛋白与Oxidase蛋白之间的相互作用关系最强。成功克隆BfrB蛋白编码基因,大小与预期相符,与表达载体pET32a连接后,经双酶切、测序验证表明重组表达载体pET32a-BfrB构建正确。IPTG诱导表达、纯化后获得条带单一、纯度较高的重组BfrB蛋白,Western blot显示重组BfrB蛋白具有良好的免疫原性,能被相应抗体识别。用该蛋白免疫新西兰大白兔能够诱导产生抗体,且其效价高达1∶512000。结论成功预测和分析了牛结核分枝杆菌BfrB蛋白的结构及功能,并获得BfrB蛋白及多克隆抗体,为后续该蛋白的研究奠定理论基础,也为牛结核病的防控等提供参考依据。

结核分枝杆菌BfrB蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学软件分析及预测结核分枝杆菌Rv3841基因编码蛋白BfrB的结构与功能。方法从NCBI数据库中获取Rv3841基因及其编码序列;利用ProtParam及ProtScale预测BfrB蛋白的理化性质及亲疏水性;应用SignalP 4.0及TMHMM分析BfrB蛋白的信号肽及跨膜区;应用SOPMA及SWISS MODEL工具分析蛋白的二级结构,建立三级结构模型;利用Bepired1.0、ABCpred及SYFPEITHI、NetMHCIIpan预测蛋白的细胞表位,寻找最佳B细胞与T细胞抗原表位。结果 Rv3841编码的BfrB蛋白具有181个氨基酸残基,平均疏水系数为-0.277,为亲水性蛋白。BfrB蛋白无信号肽序列及跨膜区域,二级结构中α螺旋约占65.19%,β折叠6.63%,β折角4.97%,无规则卷曲23.2%。预测的B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位分别为7、9、11个。结论生物信息学方法预测BfrB蛋白为亲水性蛋白,具有潜在的B、T细胞抗原表位,可作为研发新的结核病疫苗靶标。