产胆盐水解酶乳酸菌的分离、鉴定及降解胆固醇机理的初步研究

本文从开菲尔粒中分离出15株能降低胆固醇的菌,通过生理生化反应以及其他指标对这15株菌株进行鉴定,其中7株为球菌,8株为杆菌。对这15株菌进行复筛,最终筛选出一株能产胆盐水解酶的菌株,用全自动生化鉴定仪对这株菌做进一步的鉴定,其鉴定结果为干酪乳杆菌。

2株乳酸菌的生长和潜在益生菌特性

通过研究和比较2株乳酸菌——植物乳杆菌D28(Lactobacillus plantarum D28)和粪肠球菌B21(Enterococcus faecium B21)的生长曲线,对Na Cl和胆盐的耐受性,对人工胃液和人工肠液的耐受性,以及它们的体外抗氧化能力和胆盐水解酶活性,判断其是否具有益生菌特性,以期为后期菌株功能研究提供理论基础。生长曲线试验表明,L.plantarum D28的最大生长速度出现在18 h左右,而E.faecium B21为16 h左右。起始pH对2株菌生长的影响很大,L.plantarum D28的最适生长pH为5.5~7.0,而E.faecium B21为pH 6.0~7.0。耐受性试验表明:E.faecium B21对Na Cl和胆盐的耐受性较好,高于L.plantarum D28;L.plantarum D28在人工胃液(pH 2.0,180 min)和人工肠液(pH8.0,240 min)中的菌群存活率均显著高于E.faecium B21。采用DPPH(二苯基苦基苯肼)自由基清除率来测定2株菌的体外抗氧化活性,结果表明,2株菌均具有一定的抗氧化活性,且L.plantarum D28的抗氧化活性(34.86%)显著高于B21(25.32%)。采用茚三酮法测定菌株的胆盐水解酶活性发现,E.faecium B21的胆盐水解酶活性(0.415 U/mg)显著高于L.plantarum D28(0.114 U/mg)。综上表明,L.plantarum D28和E.faecium B21均具有一定的益生特性,且这2个菌株均可应用于乳酸菌降低胆固醇活性的研究,且L.plantarum D28还可以用于应用乳酸菌提高体内抗氧化活性的进一步研究中。

嗜酸乳杆菌胆盐水解酶的分离纯化及酶学性质

对嗜酸乳杆菌La-XH1产生的胆盐水解酶进行分离纯化,并对其部分酶学性质进行研究。结果表明:嗜酸乳杆菌La-XH1胆盐水解酶的粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B柱层析后的酶比活力分别为47.82 U/mg和115.85 U/mg,纯化倍数分别为4.46倍和10.82倍,酶的回收率分别为59.89%和25.11%;通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳分析,该酶的分子质量约为43 kD,最适温度为40℃,最适pH值为6.0,Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对该酶有激活作用,其中Fe3+的激活作用最强,Na+、K+对该酶几乎无作用,而Cu2+、Ba2+对该酶有很强的抑制作用。

重组融合蛋白MBP-BSH在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定

选择IF2融合标签,另选择含SUMO、GST、NusA和MBP融合标签的质粒构建表达载体。SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Escherichia Rosetta(DE3)(pLS932-BSH)的诱导表达细胞提取液上清出现了明显的融合蛋白MBP-BSH条带,经诱导表达条件优化后,MBP-BSH可溶性大幅度提高。用Ni-NTA Resin和Amylose Resin分别进行目标蛋白纯化,结果显示前者效果更好,并且C端融合His-Tag更有利于其与Ni离子结合,MBP-BSH蛋白纯化量更大,杂带更少。茚三酮显色反应测定酶活力,结果显示纯化后的MBP-BSH的酶比活力为2.4282U/mg。

蔵灵菇源克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶的特性研究

探讨蔵灵菇马克斯克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶作用底物的反应条件与金属离子对酶活性的影响及其发酵动力学类型。采用单因素多水平试验方法,在pH4～8、温度31～43℃、底物浓度4～8mmol/L及不同化学试剂(SDS、EDTA、尿素、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Al3+、Mn2+)的条件下,胆盐水解酶与底物反应30min,检测酶活力;平板活菌计数法分析细胞生长与产酶的关系;双倒数作图法求得酶促反应动力学常数Km。结果表明,胆盐水解酶最适反应条件:pH为6.0、底物浓度为7mmol/L、温度为37℃,Mn2+、Fe3+、Ca2+金属离子对酶活性有较大提高作用,其他化学试剂对酶活性影响不大。M3菌株在18～21h进入稳定期,于18h对数生长期时酶活性达到最高,表明其胆盐水解酶发酵动力学类型为生长偶联合成型。其酶促反应动力学常数Km为2.60mmol/L,说明该酶与最适底物的亲和力较大。

降胆固醇优良菌株的筛选及其胆盐水解酶特性研究

对已证实具有降胆固醇能力并能产生胆盐水解酶(BSH)的3株乳酸菌进一步筛选,综合模拟人工胃肠液的耐受性、疏水性能力和去结合胆盐能力三个指标,筛选出一株具有优良的降胆固醇综合性能的潜力菌株,并对其产生的BSH的部分特性进行研究。结果表明,屎肠球菌90-1作为降胆固醇潜力菌株其综合性能较好,其所产的BSH最适反应pH为6.0,最适反应温度为37℃,最适底物浓度为7mmol/L,最适三磷酸腺苷二钠(ATP)浓度为2.5mg/mL。

藏灵菇源克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶的分离纯化研究

为获得藏灵菇马克斯克鲁维酵母M3菌株胆盐水解酶(BSH)的纯品,探讨了BSH粗品的分离纯化方法。粗酶液采用硫酸铵分级沉淀,再以DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换介质,分别考察缓冲液pH值、流速和洗脱方式等对BSH分离纯化的影响。结果表明,在40%～70%饱和度的硫酸铵条件下BSH提取效率最高。最佳层析条件为采用pH值为6.5、50mmol/L磷酸钠缓冲体系、1.5mL/min的流速,进行分步洗脱(100mmol/L、350mmol/L、500mmol/L～600mmol/L NaCl及50mmol/L磷酸盐缓冲液3步洗脱)。在优化纯化条件下BSH的比活力可达479.55AU/mg,是原粗酶液的23.66倍。

藏灵菇源克鲁维酵母K1菌株胆盐水解酶的特性研究

探讨藏灵菇马克斯克鲁维酵母K1菌株胆盐水解酶作用底物的反应条件与不同化学试剂对酶活性的影响及其发酵动力学类型。采用单因素多水平试验方法,在pH值4～8、温度31℃～43℃、底物浓度4mmol/L～8mmol/L及不同化学试剂(SDS、EDTA、尿素、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Al3+、Mn2+)的条件下,胆盐水解酶与底物反应30min,检测酶活力;平板活菌计数法分析细胞生长与产酶的关系;双倒数作图法求得酶促反应动力学常数Km。结果表明,胆盐水解酶最适反应条件为:pH值为6.0、底物浓度7mmol/L、温度37℃,Fe3+、Ca2+、Mn2+及尿素对酶活性有较大提高作用,Mg2+、Al3+及SDS对酶的激活作用次之,Cu2+及EDTA对酶活性影响不大。K1菌株在18h～21h进入稳定期,于21h对数生长期的末期时酶活性达到最高,表明其胆盐水解酶发酵动力学类型为生长偶联合成型。其酶促反应动力学常数Km为2.10mmol/L,说明该酶与最适底物的亲和力较大。

植物乳杆菌中胆盐水解酶的研究现状及展望

益生菌的降胆固醇作用与它们所产的胆盐水解酶(bile salt hydrolase,BSH)有关,这使得胆盐水解酶成为近年来研究的热点之一。文中主要对植物乳杆菌中胆盐水解酶的克隆表达、生化特性以及降胆固醇作用等方面的研究现状进行了综述,并展望了它未来的发展方向。以期对植物乳杆菌胆盐水解酶的研究及其相关制品的开发利用提供一定的指导意义。

干酪乳杆菌GL-B体外降胆固醇的作用机理

研究了干酪乳杆菌GL-B所产胆盐水解酶的分离纯化及其体外降解胆固醇的作用机理,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FastFlow层析、Sephadex G-100层析分离胆盐水解酶。结果表明,胆盐水解酶纯度为原来的27倍,纯化后电泳谱图显示一条带,分子量约为50 ku;干酪乳杆菌GL-B对胆固醇的降解是吸收和共沉淀共同作用的结果,且共沉淀作用大于吸收作用。

动物源乳酸菌的分离鉴定以及生物学特性研究

为了筛选性状良好的动物源乳酸菌为微生态制剂的制备提供候选菌株,试验对鸡、雏鸭、甲鱼和小鼠的肠道内容物进行细菌分离鉴定,并对鉴定的乳酸菌进行耐酸、耐胆盐和生长特性研究。结果表明:从鸡、雏鸭、甲鱼和小鼠肠道内容物中各分离出了一株乳酸菌;相比其他三株乳酸菌,分离自甲鱼肠道的类肠膜魏斯氏菌生长性能优良,具备较强的耐酸、耐胆盐能力,且在pH值为7和pH值为4.5的条件下均具有较快的生长速度。说明分离自甲鱼的乳酸菌能够作为微生态制剂制备的候选菌株。

屎肠球菌132胆盐水解酶基因的克隆表达与酶学特性

该研究旨在探究降胆固醇潜在菌株屎肠球菌132胆盐水解酶(bile salt hydrolase,BSH)的活性,通过PCR技术克隆目的基因并在大肠杆菌BL21中表达,同时探讨其酶学特性。利用茚三酮法对其菌体破碎液BSH活性进行测定,比酶活达0.55 U/mg。通过克隆其目的基因,连接pET-28a(+)的表达载体并进行异源表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验显示,该酶分子量约37 ku。当底物为甘氨胆酸钠(glycocholic acid,GCA)、pH 5.50时,BSH酶活达4.93 U/mg。酶学特性结果表明,GCA为底物、pH 5.50、温度为30℃时达最适条件,BSH水解能力最强,酶活达6.59 U/mg,温度在4-30℃时,pH为5-7有较好的热稳定和pH稳定性。不同离子对酶活的影响实验表明Na^(+)、Ca^(2+)、Mg^(2+)均对酶活有激活作用;Mn^(2+)、Fe^(2+)对酶活影响不大,但Ni^(2+)、Al^(3+)、Li^(2+)、Co^(2+)、Zn^(2+)均对酶活有强抑制作用,比酶活降到10%以下,几乎丧失活性。通过酶反应动力学得出该酶的V_(max)为6.44μmol/(min·mg),K_(m)值为3.16 mmol/L。因此,通过bsh基因克隆并异源表达,提高了屎肠球菌132BSH活性,并且BSH水解各类胆盐能力较强,为降胆固醇功能食品的开发与应用奠定基础。

胆盐水解酶的分离纯化与部分特性研究

为了给胆盐水解酶结构分析及降低血液胆固醇的机理研究提供理论基础,采用硫酸铵分级沉淀、透析、阴离子交换树脂层析等方法对分离自我国传统开菲尔粒中的1株干酪乳杆菌KTx(lactobillus casei KTx)产生的胆盐水解酶进行了纯化,并对其部分特性进行了研究。结果表明:在70%的硫酸铵条件下酶蛋白能最大程度地沉淀。采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂层析,流速1.0mL/min,用0.1mol/L NaCl-50mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)洗脱,比活力可达到115(AU/mg),是原粗酶液的17倍。纯化后的样品经SDS-PAGE电泳,初步确定了胆盐水解酶的分子质量约30kDa。该酶的最适反应温度35℃,最适pH6.0,最适反应底物浓度6mmol/L,酶促反应动力学常数4.57mmol/L。抑制剂对此酶的抑制作用强弱顺序依次为:尿素>SDS>EDTA。Al3+对此酶的激活能力最强,其次是Fe3+,Zn2+对酶活无激活作用。

植物乳杆菌中胆盐水解酶基因的原核表达及纯化

目的克隆植物乳杆菌中胆盐水解酶(BSH)基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法利用PCR技术扩增植物乳杆菌BSH基因,克隆至表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET-30a-BSH经双酶切鉴定,可见961bp的目的基因条带。表达的重组蛋白相对分子质量约为40000(含6个His标签),主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的43%,纯化后,纯度达90%以上,且可与植物乳杆菌多克隆抗血清发生特异性反应。结论已成功克隆了植物乳杆菌中BSH基因,并在大肠杆菌中获得高效表达。纯化的重组蛋白纯度较高,为高效降解胆固醇的基因工程菌株的研究奠定了基础。

胆盐水解酶产生菌的筛选及其益生潜力研究

目的从健康仔猪肠道及粪便中筛选具有胆盐水解酶活性的优良益生乳杆菌菌株,并对筛选菌株的体外、体内益生潜力进行初步探讨。方法用MRS培养基分别从仔猪新鲜粪便和小肠黏膜分离培养乳酸菌,用筛选鉴别培养基筛选阳性菌株,研究菌株的抗逆能力、黏附特性以及体内益生活性。结果从粪便和小肠黏膜共得到乳酸菌388株和97株,其中胆盐水解酶阳性菌株分别为291株(75%)和86株(89%)。选择5株胆盐水解酶活性最强、能水解游离胆酸的菌株,研究菌株的抗逆能力、黏附特性以及体内益生活性,并对最终选育得到的菌株进行生理生化及16S rRNA分子鉴定,发现菌株罗伊乳杆菌G22-2能耐受pH 3.0的酸度、1.0%的胆盐浓度,在小肠上皮细胞上的黏附效率超过15个以上;通过大鼠体内实验,筛选出的菌株G22-2对大鼠无毒无害,并能显著改善血脂水平。结论罗伊乳杆菌G22-2符合益生菌的要求,可以作为产胆盐水解酶的益生乳杆菌优良的候选菌株。

长双歧杆菌NCC2705中胆盐水解酶基因的克隆表达及其特性的研究

目的克隆并过表达胆盐水解酶基因,研究胆盐水解酶对菌体胆盐耐受性和胆固醇降解率的影响等特性。方法采用常规原核表达方法在大肠杆菌BL21(DE3)和长双歧杆菌NCC2705中过表达胆盐水解酶基因,并进行长双歧杆菌NCC2705和pMgap-bsh/NCC2705的胆盐耐受性和降胆固醇实验。结果在大肠杆菌中成功表达了NCC2705的胆盐水解酶基因,经纯化的GST空标签和GST融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果显示,胆盐水解酶的相对分子质量约为35×103;构建的过表达bsh的菌株pMgap-bsh/NCC2705比标准菌株NCC2705表现出了略高的胆盐耐受性和胆固醇降解率。结论所构建的高效表达胆盐水解酶菌株可能有利于提高菌体的胆盐耐受性和降胆固醇能力,益生菌的降胆固醇途径不是单一的,培养基中是否含有胆盐对胆固醇的降解率影响较大。