新西兰白兔CTSB、CTSS基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆新西兰白兔组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)与CTSS基因CDS区序列并进行生物信息学分析,探究其在新西兰白兔不同组织中的表达规律。【方法】采用PCR法扩增并克隆CTSB、CTSS基因CDS区序列,使用Mega 7.0软件构建系统进化树并分析氨基酸序列相似性;利用生物信息学软件分析CTSB、CTSS蛋白理化性质、跨膜结构、信号肽位点及亚细胞定位情况;用实时荧光定量PCR检测CTSB、CTSS基因在新西兰白兔不同组织中的表达量。【结果】新西兰白兔CTSB、CTSS基因CDS区序列长分别为1020、1023 bp,共编码339、340个氨基酸,蛋白分子质量分别为37.627、38.253 ku,理论等电点为5.53、8.40,不稳定系数为30.76、32.38,分别为酸性及碱性蛋白。新西兰白兔CTSB、CTSS基因氨基酸序列分别与猪、马的亲缘关系最近,与鸡亲缘关系较远。CTSB、CTSS蛋白二级结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,二者三级结构预测结果与二级结构一致,均为亲水性蛋白;CTSB蛋白信号肽剪切位点位于第17—18位氨基酸处,含有1个N-端Propeptide-C1结构域与1个Peptidase-C1A-C结构域;CTSS蛋白信号肽剪切位点位于第25—26位氨基酸处,含有1个Inhibitor-129结构域与1个Peptidase-C1结构域。亚细胞定位结果表明,CTSB、CTSS蛋白均主要分布于细胞质(包括细胞壁)内。实时荧光定量PCR结果显示,CTSB基因在腹脂和肝脏组织中表达量较高,CTSS基因在脾脏组织中表达量最高,均显著高于其他组织(P<0.05)。【结论】成功克隆新西兰白兔CTSB、CTSS基因CDS全长序列,揭示了CTSB、CTSS基因在新西兰白兔不同组织中的表达水平并初步分析了其生物学功能,为进一步研究家兔CTSB、CTSS基因功能及调控机制提供了基础和参考。

水稻功能基因的电子克隆策略

电子克隆是随着基因组计划和 EST计划实施发展起来的 ,利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。已经公布的水稻基因组序列框架图 ,使得水稻的电子克隆路线得以实施。介绍了水稻电子克隆的基本原另、应用实例、相关的生物信息资源。

电子克隆技术及其在植物基因工程中的应用

电子克隆是随着基因组计划和EST计划的实施而发展起来的,是利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。它具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。因此,电子克隆技术必将成为植物基因工程中获得新基因的重要手段。阐述了电子克隆应用所依据的数据库与生物信息资源,介绍了利用电子克隆获得功能基因的方法,及其在植物基因工程中的应用现状与前景。

甘蔗Ca^(2+)/H^+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca^(2+)/H^+antiporter)是植物细胞膜Ca^(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。

陆地棉GhNIP5.1基因的电子克隆及生物信息学分析

水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是古老的通道蛋白MIP（Membrane intrinsic protein）家族成员之一，是广泛存在于动植物和微生物中，负责转运水分子和某些小分子物质的一类膜嵌入式蛋白。1992年，第一个植物水通道蛋白从拟南芥中分离获得，由于其定位在液泡膜，因此被命名为液泡膜内在蛋白（TIP）。

水牛信号转导子和转录激活子1基因电子克隆及序列分析

本研究运用生物信息学方法对水牛信号转导子和转录激活子1(signal transduction and activators of transcription1,STAT1)基因进行电子克隆及其序列分析。以牛STAT1基因序列作为探针电子克隆了水牛STAT1基因完整的编码序列并进行了RT-PCR验证。序列分析结果表明,水牛的STAT1基因序列长3437bp,包含1个2244bp的开发阅读框,共编码747个氨基酸。该基因cDNA编码区序列与普通牛、绵羊、人、猪、大鼠、小鼠和山羊同源性比对结果表明,其相似性分别为99%、98%、89%、93%、86%、85%和87%。经聚类分析结果表明,水牛与普通牛的分子进化关系最近。

生物信息学在发现新基因方面的应用

自生物信息学作为一门交叉学科诞生以来,其在计算机、农业和生命科学等各方面发挥了重要的作用,在后基因组时代,更是成为发现新基因的重要手段。对生物信息学的概况做了回顾与展望,并简述了生物信息学近年在发现新基因方面所取得的成果。

森林草莓精氨酸脱羧酶基因的电子克隆与序列分析

从森林草莓中分离精氨酸脱羧酶基因(FvADC),分析其表达模式、序列特征和进化关系。采用电子克隆结合RT-PCR分离FvADC;半定量RT-PCR检测其在盐、热、冷胁迫下的表达情况;生物信息学分析FvADC的结构与进化。结果获得FvADCcDNA全长,包括2 154 bp的编码区,RT-PCR验证编码区序列与电子克隆序列一致;FvADC基因编码的精氨酸脱羧酶与桃、苹果和海棠的同源性分别达87%、84%和83%,含信号肽,具有2个保守的氨基酸结构域:ADC家族2磷酸吡哆醛结合位点和ADC家族2标记2序列;进化分析表明森林草莓精氨酸脱羧酶与苹果、桃精氨酸脱羧酶关系最近;半定量RT-PCR证实FvADC在盐、热、冷胁迫下诱导表达。以上结果说明电子克隆能用于草莓基因的分离,而FvADC可作为逆境候选基因用于草莓遗传改良。

甘蔗Na^+/H^+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析

Na^+/H^+逆向转运蛋白基因SOS1(salt overly sensitive 1)是植物耐盐性的必需基因之一,在植物抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。本研究以小麦EST序列KJ563230为探针,利用电子克隆技术结合RT-PCR,获得一条甘蔗SOS1基因的cDNA序列,命名为ScSOS1(GenBank登录号为KT003285)。序列分析结果表明,该基因全长1403 bp,包含一个1272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸的蛋白质。ScSOS1蛋白的相对分子质量为47.6 kD,理论等电点(pI)为9.12。氨基酸序列分析表明,ScSOS1蛋白具有一个CAP-ED superfamily结构域。生物信息学预测显示,ScSOS1的编码蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与中间代谢。实时荧光定量PCR分析表明,ScSOS1基因的表达具有组织特异性,在甘蔗叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽和根中均有表达,其中在叶鞘中的表达量最高,根中的表达量最低。此外在NaCl、PEG、ABA、SA和MeJA的胁迫过程中,该基因表达均受到调控,其中受NaCl和PEG诱导后上调表达,均在24 h表达量达最高,分别约为对照组的1.5倍和4.0倍。推测该基因的表达与甘蔗耐盐性和抗渗透胁迫有关。

通过新基因计算机识别与实验确认对NCBI人类基因数据库一些模式参考序列错误的分析与纠正

采用生物信息学分析与实验确认相结合的技术路线 ,通过所识别的基因在非冗余数据库比对发现了网上公布的计算机注释人类基因组编码序列存在各种类型的多处错误 ,包括cDNA水平的一个或一段碱基插入、缺失或突变 ,或是这些错误的不同排列组合 ,其中以错误插入为多 ,往往导致编码氨基酸的移码突变。最先举证了NCBIGENOMEAnnotationProject预测人类新基因的下列错误类型 :(1)开放读码框架 (ORF)中错误插入一个碱基造成编码氨基酸移码 ;(2 )错误拼接 ;(3)开放读框中错误插入一个或一段碱基造成该读框提前终止。只编码N 端氨基酸的cDNA序列而不完整 ;(4 )只有编码C 端氨基酸序列的cDNA而不完整 ;(5 )只是正确基因ORF中间的一段编码蛋白cDNA序列而不完整 ,缺N 端与C 端氨基酸序列 ,并且将不完整蛋白氨基酸序列的第一个非起始码氨基酸错误地预测为起始码氨基酸 ,如将L错误地预测为M ;(6 )开放读框中错误插入一个或一段碱基造成前面出现不该有的终止码 ,因而编码蛋白缺开头部分氨基酸 ;(7)可能将污染基因组序列当作完整基因cDNA序列对待而预测出所谓单一外显子基因。即便真是基因 ,也只是较长单一外显子mRNA中有一小ORF ,而ORF起始码上游同一相位确实存在终止码 ,无其他特点符合基因条件 ;(8)所预测基因只有ORF ,

香蕉MYB转录因子基因的电子克隆及生物信息学分析

采用电子克隆方法获得香蕉MYB基因。通过生物信息学方法,对此序列编码的蛋白质从氨基酸组成、理化性质、疏水性/亲水性、结构域及其空间结构等方面进行了预测和分析。结果表明:香蕉MYB基因编码序列全长1 266 bp,包含1 266 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,含有1个保守的MYB功能域、1个SANT保守结构域。在序列组成、理化性质、结构域及空间构象等方面,与小麦等其他植物的MYB转录因子具有高度的相似性。

甘蔗苏氨酸脱氨酶基因的克隆与表达分析

应用电子克隆技术．以烟草AAG59585序列为探针．获得了甘蔗苏氨酸脱氨酶（threonine deaminase）基因的全长cDNA，命名为Sc功。经RT—PCR扩增和验证，该基因序列与电子克隆结果一致性高达99％。序列分析结果表明：ScTD基因全长2120bp，具有完整的开放阅读框（ORF，164－1681bp），编码505个氨基酸，该基因编码蛋白定位于微体．为可溶性蛋白，不存在信号肽，二级结构原件多为α－螺旋，含有多个保守功能域，主要在氨基酸合成中发挥作用。电子表达分析结果显示，该基因在甘蔗根尖、根颈、花序、叶片、全株、芽和茎中组成型表达，其中在花序和根中的表达量最高。荧光定量PCR结果分析表明：该基因在甘蔗各组织中均有表达，且在根中的表达量最高。此外，该基因的表达受水杨酸胁迫后表达量最高．约为对照组的43．16倍，其次为聚乙二醇和茉莉酸甲酯．分别为6．90倍和4．40倍．推测该基因的表达与甘蔗抗病虫和抗渗透胁迫有关。此结果为甘蔗ScTD基因的克隆和功能验证以及在甘蔗基因工程中的应用奠定基础。

甘蔗MYB2转录因子的电子克隆和生物信息学分析

用电子克隆方法获得甘蔗MYB2基因,采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明:甘蔗MYB2基因全长991bp,包含570bp的ORF,编码189个氨基酸。甘蔗MYB2基因包含有MYB功能域,在序列组成、高级结构及活性位点等方面,与玉米等其它植物的MYB2基因具有高度的相似性。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。

甘蔗几丁质酶基因的电子克隆与生物信息学分析

用电子克隆方法获得甘蔗几丁质酶基因SCCHI1,采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明:SCCHI1基因全长1236bp,包含一个完整的990bp的ORF,编码329个氨基酸。SCCHI1基因属于糖苷水解酶19家族,含有N-端信号肽、交连区、催化区,与高粱等其它植物的几丁质酶基因具有高度的相似性。为SCCHI1基因的分子克隆、功能鉴定和应用提供参考。

甘蔗过氧化氢酶基因的电子克隆及生物信息学分析

应用电子克隆技术,获得甘蔗中一个过氧化氢酶基因的cDNA序列全长,命名为S-CAT。该基因全长2160bp,包含一个1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。通过PSORT工具,预测甘蔗S-CAT蛋白存在于过氧化物酶体中。同源比对分析显示,S-CAT基因编码的氨基酸序列与水稻、玉米、高粱、朝鲜碱茅、葡萄等植物中过氧化氢酶基因所编码的氨基酸序列高度同源,同源性分别为97%,97%,95%,91%和92%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。

割手密谷胱甘肽硫转移酶基因SsGST的克隆与生物信息学分析

为克隆割手密谷胱甘肽硫转移酶基因,采用电子克隆和RT-PCR技术获得了1个割手密GST基因,命名为Ss GST,并对其进行生物信息学分析。序列分析表明,割手密Ss GST基因c DNA全长702 bp,编码224个氨基酸,蛋白分子式为C1119H1756N300O327S5,预测蛋白质分子量为24.8 ku,等电点为6.21。蛋白疏水性分析表明Ss GST蛋白为亲水性蛋白。保守结构域预测表明Ss GST蛋白具有GST-N和GST-C结构域。Ss GST蛋白序列与玉米、高粱、谷子和甘蔗等植物的GST蛋白序列相似性较高,系统进化树分析表明,Ss GST蛋白与玉米GST蛋白亲缘关系最近。

鸡堆型艾美耳球虫新基因的克隆与生物信息学分析

试验旨在对堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）孢子化卵囊新基因EST序列进行克隆与生物信息学分析。通过RACE技术扩增从E．acervulina cDNA表达文库中筛选获得的EST序列，得到EST全长cDNA序列，利用多种生物信息学分析软件对其编码蛋白进行分析和预测。结果表明，该EST序列为E．acervulina孢子化卵囊阶段新基因，GenBank登录号为EU590120；该基因含1个492 bp的开放阅读框，编码163个氨基酸，理论分子质量为17．049 ku，等电点为6．69，酸性氨基酸8个，碱性氨基酸8个，分子式为C761H1223N199O219S12总平均亲水性（GRAVY）为0．731；该蛋白有信号肽，为分泌性蛋白；具有4个跨膜结构，在105～115、28～32和132～138位之间有很强的疏水性；具有1个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N端豆蔻酰基化位点。因此根据生物信息学全面预测和分析，发现该基因所编码的蛋白具有较多的生物学功能位点和潜在的抗原表位区域。

甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析

以高粱β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase gene)cDNA序列为探针,搜索甘蔗EST数据库,而后通过电子克隆技术,拼接获得甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因ScBG。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、卷曲螺旋、亚细胞定位、信号肽、功能域及高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:ScBG基因全长1270bp,包含一个长达1011bp的完整开放读码框(open reading frame,ORF),编码336个氨基酸,分子量为34.8KD,理论等电点为4.98。该蛋白质很可能是胞外定位的诱导物释放型酸性葡聚糖酶,是一种稳定的分泌蛋白,且可信度达最高等级1。该蛋白属于糖苷水解酶第17家族,含有N端信号肽,在第7～29位氨基酸处含有跨膜信号区,在第31～321位氨基酸处含有糖苷水解酶17家族结构域,含2个主要的功能结构域。10个物种ScBG蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,甘蔗ScBG基因编码蛋白与高粱β-1,3-葡聚糖酶基因的编码蛋白的同源性最高,达79.82%。以上研究结果为ScBG基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用提供基础。

高粱SAMDC基因的电子克隆与生物信息学分析

以小麦S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)cDNA序列为信息探针,基于高粱EST数据库,通过电子克隆技术获得一个全长为2088 bp的高粱SAMDC基因。采用生物信息学方法对其开放读码框、理化性质、二级结构、结构域等进行分析。结果表明:此contig片段包含一个长达1197 bp的完整开放读码框,编码398个氨基酸,分子量为43 246.0 KD,理论等电点为4.88;二级结构主要构件为无规则卷曲,结构功能域属于S-腺苷甲硫氨酸超家族。同源性分析表明,高粱SAMDC基因编码的蛋白与甘蔗SAMDC基因编码的蛋白同源性达94%。以上研究结果为进一步克隆该基因及功能验证奠定了基础。

小麦相关功能基因的全基因组电子定位及基因注释

电子克隆技术是通过对基因组或EST序列的组装和拼接快速获得功能基因的方法。运用电子克隆技术,以小麦功能标记为探针,在小麦全基因组数据库中克隆与之相对应的小麦功能基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,运用UMN19,bx7_f_r,ZSBy9F2_R2,PPO33,Sus2_SNP_227_589L2,Pin_b_1,YP7A,cssfr7这些功能标记,可以克隆出与之相对应的功能基因。研究有助于下一步对小麦相关功能基因进行精细作图、图位克隆及分子标记辅助育种等工作。