A Simple Method Designed for the Separation of Biotinylated Ligate from Free Biotin

ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＤｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｏｆｂｉｏｔｉｎｌａｂｅｌｉｎｇ，ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｒｅａｇｅｎｔｆｒｏｍｂｉｏｔｉｎｙ－ｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｓｔｅｐ，ｅｓｐｅｃｉ...

热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用

新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。

生物素标记钙调素用于植物钙调素结合蛋白的检测

用生物素标了己了花椰菜ＣａＭ。生物素标记的ＣａＭ具有与天然ＣａＭ相似的Ｃａ２＋依赖电泳特性，可激活ＣａＭ依赖性磷酸二酯酶，能够检测出５０ｎｇ的磷酸二酯酶。利用它建立了检测植物ＣａＭ结合蛋白的生物素－覆盖法（Ｂｉｏｔｉｎ－ｏｖｅｒｌａｙ）并证实酶标亲和素可与胡萝卜愈伤组织内６４ｋＤ蛋白质非特异结合，因此将此法运用于植物材料时必需设置酶标亲和素处理的对照。用生物素－覆盖法检测胡萝卜愈伤组织形成过程中的ＣａＭ结合蛋白时可检出２，４－Ｄ诱导的ＣａＭ结合蛋白。

检测SortaseA酶催化蛋白质连接效率的新型报道系统

利用分子进化技术对Sortase A酶的催化活性进行定向改造已经成为当前的研究热点和重点,为了高效筛选特定催化活性的Sortase A酶突变体,需要建立一种能够快速准确鉴定Sortase A酶活性的方法。为此,设计了由GFP-LPETG蛋白和GGGYK-Biotin组成的新型报道底物系统。利用重组基因工程技术,成功制备GFP-LPETG蛋白,野生型Sortase A酶及近期报道的一个高活性突变型Sortase A酶。以GFP-LPETG及GGGYK-Biotin为报道底物建立连接体系,结果显示,连接反应动力学可直接通过SDS-PAGE凝胶电泳法精确测定。用此连接体系比较野生型与突变型Sortase A酶催化的连接反应效率,证实高活性突变酶具有野生酶无法比拟的高催化活性。此报道系统简单快速灵敏,可应用于系统的筛选,为后续进一步定向优化Sortase A酶奠定了基础。

活细胞内临近标记技术BioID在蛋白质相互作用研究中的进展

蛋白质往往通过形成复合物或蛋白质间相互作用来执行功能,研究蛋白质相互作用网络具有重要意义。临近依赖的生物素识别技术(proximity-dependent biotin identification technology, BioID)是一种在活细胞中鉴定互作蛋白质组的新工具,其通过构建靶蛋白-生物素连接酶融合蛋白系统,使靶蛋白及其临近蛋白发生生物素化,进而直接鉴定生物素化蛋白,从而确定靶蛋白的相互作用网络。与其他传统的蛋白质互作研究方法相比,BioID可用于鉴定微弱/瞬时相互作用、难溶性蛋白的相互作用以及翻译后修饰介导的蛋白相互作用等。本文针对利用BioID鉴定不同类型蛋白质的相互作用蛋白质组展开综述。