可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建可生物素化的H-2Kd-BSP融合基因的表达载体,原核表达H-2Kd-BSP融合蛋白,以制备H-2Kd-肽四聚体。方法采用RT-PCR技术从小鼠SP2/0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2Kd基因的胞外区,拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP)后,插入pET-22b高效表达载体多克隆位点,诱导表达后对表达产物进行纯化,用Western印迹法分析鉴定纯化融合蛋白。结果成功构建pET-H-2Kd原核表达载体,测序证实H-2Kd-BSP融合基因序列正确。pET-H-2Kd原核表达载体可在大肠杆菌BL21中高效诱导表达H-2Kd-BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的36%,主要以包涵体形式表达;经反复洗涤纯化,纯化蛋白纯度可达90%以上。纯化蛋白可被H-2Kd分子特异性单克隆抗体SF1-1.1所识别。结论可生物素化H-2Kd-BSP融合蛋白的原核表达和纯化为进一步制备H-2Kd-肽四聚体奠定了实验基础。

HLA-A＊0201-BSP融合基因的构建与原核表达

克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区是制备HLA-A*0201-肽四聚体的先决条件。本研究构建重组HLA-A*0201-BSP融合基因的表达载体,以制备HLA-A2四聚体。根据已报道的序列设计特异引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从已鉴定为HLA-A*0201基因型的健康人白细胞中克隆HLA-A*0201重链胞外区的基因,拼接上依赖生物素-蛋白连接酶(biotin-proteinligase,BirA)的可生物素化序列(BirAsubstratepep-tide,BSP),构建HLA-A*0201-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果表明:成功扩增出HLA-A*0201-BSP融合基因并测序证实,构建的pBV220-HLA-A*0201-BSP可在大肠杆菌DH5α中高效表达HLA-A*0201-BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的28%,以包涵体的形式表达,经洗涤、变性后,以SepharcylS-300HR(S-300)柱层析纯化,纯度可达90%以上。结论:获得了高效表达HLA-A*0201-BSP的大肠杆菌工程菌株,建立了简便有效的包涵体纯化方法,为制备HLA-A*0201-肽四聚体奠定了基础。

自发生物素化风疹病毒重组诊断抗原的制备

目的 获取原核表达过程中自发生物素化的风疹病毒（Rubella Virus,RV）重组抗原E1（RV-E1）,并初步评价其抗原性.方法 将2×BirA酶底物（BSP）插入到RV-E1抗原优势表位区域aa 148-295的羧基端,硫氧还蛋白（Thioredoxin,TRX）插入到RV-E1的氨基端,密码子优化后全基因合成;在大肠埃希进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化获取生物素化的RV-E1抗原;利用Western Blotting技术对目的蛋白进行鉴定,并建立风疹病毒IgM抗体检测方法,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.结果 获取高度均质的生物素化的可溶性RV-E1抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被RV-E1抗原和TRX抗原单克隆抗体识别,而且可以被标记HRP的链霉亲和素所识别.分别对50份风疹病毒感染阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异.结论 RV-E1诊断抗原携带BSP,可以在大肠埃希菌表达过程中自发共价结合生物素分子,并可以作为新型诊断抗原应用于生物素-亲和素ELISA血清学检测中.