烟台黑猪SLA-I重链基因末端生物素修饰及表达

为构建烟台黑猪SLA-2重链基因偶合生物素化酶BirA底物肽(BirA substrate peptide,BSP)并研究其在pET-28a(+)中的表达,设计烟台黑猪SLA-2-BSP复合基因引物,PCR扩增烟台黑猪SLA-2-YTH-BSP复合基因,并克隆至pMD 19-T Simple Vectorp,经酶切鉴定后将SLA-2-YTH-BSP复合基因与表达系统pET-28a(+)链接,并转化到BL21(Rosseta)菌进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。表达蛋白经过Ni-NTA亲和纯化,并经SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。PCR结果显示SLA-2-BSP大小为900 bp,并成功克隆到pMD 19-T Simple Vector,酶切鉴定大小为876 bp,该基因链接到pET-28a(+)并转化到BL21(Rosseta)菌,经诱导表达和SDS-PAGE检测目的蛋白的大小为32.4 kD。目的蛋白以包涵体形式存在,纯化后蛋白纯度达到90%以上。成功构建烟台黑猪SLA-I重链偶合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的pET-28a(+)的重组表达系,为下一步的SLA-I类分子四聚体研究鉴定基础。

HLA-A*0201/BSP融合基因的构建与表达

目的:克隆表达HLA-A*0201 α链胞外区与BirA酶底物肽(BirA substrate peptide,BSP)的融合蛋白。方法:采用PCR技术从人HLA-A*0201 α链cDNA库中克隆基因的胞外区,拼接可生物素化的BSP片段序列后,经双酶切插入载体pET28a(+)后在E.coli BL21(DE3)诱导高效表达,并对表达产物进行纯化与复性。结果:成功地扩增出HLA-A*0201／BSP基因并测序证实,构建了融合表达载体pET-HLA-A*0201,并获表达与纯化。结论:成功构建了HLA-A*0201／BSP融合基因,为进一步体外构建特定的HLA-A*0201四聚体,标记相应特异性CD8+T细胞提供物质基础。

自发生物素化风疹病毒重组诊断抗原的制备

目的 获取原核表达过程中自发生物素化的风疹病毒（Rubella Virus,RV）重组抗原E1（RV-E1）,并初步评价其抗原性.方法 将2×BirA酶底物（BSP）插入到RV-E1抗原优势表位区域aa 148-295的羧基端,硫氧还蛋白（Thioredoxin,TRX）插入到RV-E1的氨基端,密码子优化后全基因合成;在大肠埃希进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化获取生物素化的RV-E1抗原;利用Western Blotting技术对目的蛋白进行鉴定,并建立风疹病毒IgM抗体检测方法,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力.结果 获取高度均质的生物素化的可溶性RV-E1抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被RV-E1抗原和TRX抗原单克隆抗体识别,而且可以被标记HRP的链霉亲和素所识别.分别对50份风疹病毒感染阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异.结论 RV-E1诊断抗原携带BSP,可以在大肠埃希菌表达过程中自发共价结合生物素分子,并可以作为新型诊断抗原应用于生物素-亲和素ELISA血清学检测中.