苦瓜McMLO11基因克隆及其表达模式分析

【目的】克隆苦瓜McMLO11基因并研究其在白粉病和非生物胁迫下的表达规律,为阐明其在逆境调控中的作用提供参考。【方法】从苦瓜叶片中克隆McMLO11基因,利用生物信息学对其分子特征进行分析,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,检测McMLO11基因在苦瓜不同组织(茎、卷须、老叶、嫩叶、根)及白粉菌侵染和盐、干旱胁迫下苦瓜真叶中的表达模式。【结果】苦瓜McMLO11基因含有1个1662 bp的开放阅读框(ORF),共编码553个氨基酸;McMLO11属于MLO基因家族,包含典型的Mlo超家族保守结构域。McMLO11蛋白的相对分子质量为63.83 ku,理论等电点为8.53,含7个跨膜域,无信号肽,属于不稳定蛋白;其二级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋组成。系统进化树分析表明,McMLO11与黄瓜、南瓜、冬瓜等瓜类的MLO同源性较高。qRT-PCR检测发现,Mc-MLO11基因在苦瓜不同组织中的相对表达量依次表现为茎>卷须>老叶>根>嫩叶;与对照相比,白粉菌侵染后苦瓜叶片中的McMLO11表达量升高,至接种24 h达到峰值,推测其在白粉菌侵染苦瓜的早期产生应答反应;与对照相比,在盐胁迫6 h和干旱胁迫12 h时苦瓜叶片中的McMLO11相对表达量达到峰值,分别为对照的56.7和9.07倍,提示McMLO11基因可积极响应干旱和盐诱导。【结论】成功克隆了苦瓜McMLO11基因,其表达具有组织特异性,该基因可能参与白粉菌胁迫和多种非生物胁迫的调控过程。

苦瓜McPDS基因克隆及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

以苦瓜八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因为靶标,构建其特异gRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以期为建立苦瓜CRISPR/Cas9基因编辑技术体系奠定基础。以苦瓜自交系B07叶片cDNA为模板,同源克隆苦瓜McPDS基因CDS序列。结果表明,McPDS基因CDS序列全长1731 bp,编码576个氨基酸,蛋白质相对分子质量为64.44 kD,理论等电点(PI)为7.09。跨膜结构分析结果表明,该蛋白为亲水性非跨膜蛋白。系统进化树分析结果表明,McPDS与黄瓜、甜瓜等葫芦科植物中的PDS蛋白同源性较高。此外,以McPDS为靶标基因,在5’端筛选2个高特异性靶点,经设计引物,成功构建1个双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体,为苦瓜基因编辑体系的建立奠定了技术基础。

基于转录组测序的苦瓜皂苷合成相关基因的鉴定和分析

【目的】皂苷是苦瓜果实苦味的主要来源,具有降血糖、抗癌等多种药用价值。鉴定和挖掘参与调控苦瓜皂苷生物合成的代谢通路及基因,为进一步深入解析苦瓜皂苷形成的分子机制提供参考。【方法】以苦瓜高代自交系GK24为试验材料,分别在子房期(T1)、幼果期(T2)、商品果期(T3)和完全成熟期(T4)取果实组织,通过香草醛-冰醋酸法测定不同时期的苦瓜皂苷含量,利用转录组测序的方法鉴定差异表达基因。【结果】从T1到T4,苦瓜内源皂苷含量随着果实发育而呈现显著下降的趋势。转录组测序共鉴定到17 504个基因,在T1-vs-T2、T2-vs-T3和T3-vs-T4三组比较中,下调表达基因数量均高于上调表达基因数量。GO富集分析表明含磷复合物代谢过程、驱动蛋白复合体和2-琥珀酰-6-羟基-环己二烯-1-羧酸合成酶活性分别是生物过程、细胞组分及分子功能模块最显著富集的条目。KEGG分析显示全局与概述图谱、碳水化合物代谢和氨基酸代谢是3组比较中共同的最显著富集的代谢通路。根据表达模式可将基因划分为20个模块,其中profile 0中基因的表达量从T1到T4逐渐降低,与苦瓜果实发育过程中皂苷含量变化规律一致。从profile 0中鉴定出与苦瓜皂苷生物合成相关的基因14个,包括萜类骨架生物合成通路上的基因AAT1、HMG1、MVK、PMK、MVD2和FPS1,倍半萜与三萜生物合成途径中的基因SS12、SQE1和CPQ及后修饰酶基因CYP97A3、CYP71AN24、UGT94E5及UGT73C6。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果与RNA-seq结果一致。【结论】苦瓜果实中皂苷含量随着果实不断成熟而逐渐降低。苦瓜皂苷生物合成首先通过上游的萜类骨架生物合成(ko00900)代谢途径完成萜类皂苷骨架的积累,随后通过倍半萜与三萜生物合成(ko00909)代谢途径以及下游的氧化还原酶、糖基转移酶的修饰最终生成皂苷,本研究通过转录组测序共鉴定到14个与苦瓜皂苷生物合成相关的基因。

苦瓜品质性状主基因+多基因混合遗传效应分析

开展苦瓜(Momordica charantia L.)干物质含量、可溶性蛋白质含量和硝酸盐含量的品质性状研究,分析其遗传机制。以苦瓜雌性系Z-1-4为母本,优质苦瓜高世代自交系2538、5325和5321为父本,构建3个组合的4个世代[P_(1)(亲本)、P_(2)、F_(1)、F_(2)]遗传群体,并结合主基因+多基因混合遗传模型对苦瓜干物质含量、可溶性蛋白质含量和硝酸盐含量进行遗传及相关分析。结果表明,苦瓜干物质含量最适遗传模型为等加性主基因加性+多基因模型,且遗传率较高;苦瓜可溶性蛋白质含量最适遗传模型为负向完全显性主基因+加性-显性多基因模型,遗传率较低,适合在早期世代进行遗传选择。商品瓜硝酸盐含量最适遗传模型为2对加性-显性主基因+加性-显性多基因模型,遗传率也较低。可溶性蛋白质与硝酸盐的遗传率均相对不高,适合在高世代进行表型选择。

黄瓜叶色突变、苦味与其他5个性状的基因间连锁遗传关系

为探索黄瓜叶色突变基因v-1(新发现暂定)、营养器官无苦味基因bi及果实苦味基因Bt与雌 性F基因、暗色果皮D、果色一致基因u、小刺基因ss、绿色果皮dg基因(暂定)之间的独立或连锁关 系,以含有上述基因的4个黄瓜纯合亲本为试材,通过对亲本、F1和F2分离性状的调查,表明bi与v-1有 连锁,连锁距离为33.9cM。bi、Bt、v-1与F、D、u、ss、dg基因之间不存在连锁关系。

黄瓜无苦味种质资源的SSR标记鉴定

鉴定无苦味种质,选育无苦味品种是控制黄瓜苦味、改善品质的有效方法。利用黄瓜营养器官苦味基因的标记SSR02309和果实苦味基因的标记SSR10795,对78份种质资源进行苦味基因型分析,表明黄瓜种质间和种质内苦味基因的标记基因型存在遗传变异性。明确了78份种质苦味基因的标记基因型。初步鉴定出7份无苦味种质。在田间逆境胁迫条件下,利用感官品尝方法对标记鉴定的7份无苦味种质的苦味性状进行了感官品尝鉴定,结果与标记鉴定的一致。为无苦味黄瓜品种改良奠定了技术与种质基础。

苦瓜α-苦瓜素基因克隆与单倍型分析

为了揭示苦瓜α-苦瓜素基因的完整结构及单倍型,本研究以35份苦瓜初级核心种质为材料,克隆α-苦瓜素基因,结果显示,α-苦瓜素基因全长993 bp,包括60 bp的5'-UTR,72 bp的3'-UTR,861 bp的ORF,无内含子序列,编码286个氨基酸,α-苦瓜素蛋白含有RIP蛋白保守结构域。系统进化分析结果表明,除苦瓜RIP P16094.2外,α-苦瓜素蛋白与胶苦瓜3MRW_A的亲缘关系最近,而与苦瓜MAP30蛋白的亲缘关系较远。通过比较35份苦瓜种质资源α-苦瓜素基因序列,共发现5个SNP位点,5个SNP位点均位于编码区。SNP分组发现,35份苦瓜种质资源α-苦瓜素基因共存在5种单倍型。5种单倍型编码的氨基酸序列比对显示,共存在1个氨基酸变异位点,氨基酸变异位点对应于第5个SNP位点,第1、第2、第3、第4 SNP位点并未引起氨基酸的改变。该结果为进一步研究α-苦瓜素基因表达调控机制和不同单倍型编码蛋白功能差异奠定了基础。

苦瓜MADS盒基因的克隆和表达研究

根据MADS box基因保守区结构 ,设计简并性引物 ,利用 3’RACE方法 ,从苦瓜 (MomordicacharantiaL .)中分离出花特异表达基因的cDNA片段 .同时利用 5’RACE方法获得了全长cDNA ,命名为BAG .序列分析表明 ,该cDNA全长 10 0 1bp ,含一个编码 2 2 8个氨基酸的完整开放阅读框 ,5’端和 3’端非翻译区分别为 5 0、2 6 7个碱基 ,poly(A)尾巴长 2 2个核苷酸 ,具有典型的植物MADS box基因的结构 .该基因编码的蛋白质与黄瓜 (CUM10 ,CAG1) ,棉花(GHMADS 2 ) ,以及拟南芥AGL11等MADS盒基因蛋白质的同源性分别为 :95 %、93%、84 %、72 % .Southern杂交分析显示 ,在基因组中至少有两个拷贝存在 .应用RT PCR和Northern杂交结果证实 。

苦瓜McAPX2基因及其启动子的克隆与表达分析

基于苦瓜叶片均一化文库克隆得到McAPX2基因的cDNA全长序列(Gen Bank登录号:KJ722767.1),采用染色体步移法获得该基因的启动子序列,实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同器官中的表达量及低温胁迫对McAPX2表达量的影响。结果表明:McAPX2基因全长1 086 bp,开放阅读框747 bp,编码249个氨基酸;McAPX2属于过氧化物酶家族ClassⅠ的成员,其脂肪族氨基酸指数为83.90,是一个亲水性蛋白,可推测定位于细胞质中;与甜瓜(NP_001284378.1)、黄瓜(ACO90193.1)、南瓜(AHF27424.1)、苦瓜(AGJ72851.1)同源性较高,分别为95%,94%,94%和93%;q RT-PCR结果显示,在苦瓜的根、茎、叶、雌花和幼果等组织器官中McAPX2的表达量存在显著差异,其中根的表达量最大,而在叶片中的表达量最低;在低温胁迫下,随着胁迫时间的延长,McAPX2表达量逐渐上调,处理12 h时达到最大,随后下降,说明该基因的表达与苦瓜耐低温胁迫相关。分离得到McAPX2基因上游调控序列1 267 bp,其启动子含有与GA、ABA、CTK、乙烯等激素和病原菌等生物胁迫以及热激、干旱、低温、光等非生物胁迫的相关元件。

全雌系苦瓜ACC合成酶基因cDNA克隆及序列分析

以全雌系苦瓜‘X-Hei-d-d’花蕾为材料,根据已报道ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)保守氨基酸序列设计简并引物,采用RT-PCR技术及序列拼接,获得了全雌系苦瓜ACS基因cDNA序列,命名为Mc-ACS4(GenBank登录号:FJ459814)。该序列包含一个1 455 bp的完整开放阅读框,编码484个氨基酸,具有7个保守区;系统进化上与普通苦瓜ACS基因首先聚类,同源性达99%,二者仅有2个氨基酸差异,推测可能与全雌系苦瓜性别分化有关。

苦瓜强雌性状的遗传分析

以强雌性苦瓜品系09C-51、09C-54和普通性型品系09C-57为亲本配制杂交组合,调查单株主茎50节位内的雌花节率。通过对两个组合的P1、P2、F1、F2、BC1P1各世代植株的性型观察,并经χ2测验,表明苦瓜强雌性性状由1对不完全显性基因控制。利用组合09C-51×09C-57的Pl、P2、Fl、F2群体的性型分离数据,进一步对性型进行数量遗传学分析,表明强雌性性状符合1对显性主基因+加性-显性多基因模型,说明苦瓜强雌性性状由1对主基因控制,且存在微效多基因的影响,其主基因遗传率为63.06%,多基因遗传率为26.96%。

苦寒药与生物钟基因的关系研究进展

苦寒类中药善于清热燥湿以改善机体内环境稳态,目前在临床上被广泛应用于糖尿病、肥胖、炎症、菌群失调等慢性或代谢性疾病,而这些疾病往往都伴随着机体生物钟系统的失衡。改善生物钟失衡可能是苦寒药治疗这些疾病的作用机制之一,同时,在生物钟的调控下,机体新陈代谢及内分泌等行为的节律性波动也可能影响苦寒药的药效。既往对苦寒药在临床应用上的研究大部分集中于胃肠动力及激素等基础研究上,从生物钟基因的角度鲜有见到深入的研究与阐述。因此,本文从临床常用苦寒药对生物钟基因的影响及生物钟基因对苦寒药作用的影响两个方面探讨苦寒药的应用,同时分析二者之间的关系和归纳苦寒药影响生物钟基因共同的物质基础,以期为苦寒药作用多靶点以及指导临床合理用药和中药药性物质基础研究提供参考。

果子狸苦味受体Tas2R2基因的克隆与序列分析

采用PCR和克隆测序方法首次从果子狸基因组中获得一全长为1 037 bp的苦味受体Tas2R2基因DNA序列。该序列含有完整的1个外显子(无内含子),大小为915 bp,编码304个氨基酸残基。其蛋白质等电点为9.84,分子量为34.87 ku。高级结构预测显示果子狸Tas2R2蛋白由4个胞外区、7个跨膜区和4个胞内区组成,该蛋白上含有N糖基化位点、丝氨酸磷酸化位点、色氨酸磷酸化位点各3个和酪氨酸磷酸化位点1个。亲水性/疏水性分析表明,果子狸Tas2R2蛋白质为疏水性蛋白,其亲水性区段所占比例较小。种间同源性比较显示,果子狸Tas2R2基因与猫、犬、大熊猫、牛、马、黑猩猩和小鼠的cDNA序列同源性分别为93.0%、89.4%、89.9%、85.4%、85.9%、84.6%、72.2%;氨基酸序列同源性分别为88.8%、81.1%、83.2%、75.9%、77.8%、75.5%、61.3%。果子狸、猫、犬、大熊猫、牛、马、黑猩猩和小鼠的Tas2R2基因编码序列构建的进化树表明果子狸与猫的亲缘关系最近。

猪獾苦味受体T2R2基因的分子克隆与进化分析

苦味的感知是机体有效的自我保护机制之一。文章采用PCR和克隆测序方法首次从猪獾基因组中获得一全长为1169bp的苦味受体T2R2基因DNA序列(GenBank登录号:FJ812727)。该序列含有完整的1个外显子(无内含子),大小为915bp,编码304个氨基酸残基。其蛋白质等电点为9.76,分子量为34.74kDa。拓扑结构预测显示猪獾T2R2蛋白上含有N?糖基化位点、N-肉豆蔻酰化位点各1个,蛋白激酶C磷酸化位点2个。整个蛋白质多肽链含有7个跨膜螺旋区,4个细胞外区和4个细胞内区。亲水性/疏水性分析表明,猪獾T2R2蛋白质为一疏水性蛋白,其亲水性区段所占比例较小。种间相似性比较显示,猪獾T2R2基因与犬、猫、牛、马、黑猩猩和小鼠的T2R2基因cDNA序列相似性分别为91.4%、90.6%、84.4%、85.4%、83.8%、72.1%,氨基酸序列相似性分别为85.5%、85.8%、74.0%、77.6%、75.3%、61.5%。核苷酸替换计算和选择性检验结果表明,猪獾T2R2基因与犬、猫、牛、马、黑猩猩和小鼠间存在着强烈的纯净化选择(Purifying selection),即强烈的功能束缚(Functional constraint),进一步分析发现该选择作用实际上主要存在于跨膜区。猪獾、犬、猫、牛、马、黑猩猩和小鼠的T2R2基因外显子核苷酸序列构建的基因树与其物种树的拓扑结构是相一致的,表明T2R2基因适合于构建不同物种间的系统进化树。

苦瓜白粉病抗性的主基因＋多基因混合遗传模型分析

通过统计苦瓜白粉病的病情指数,研究白粉病抗性的遗传规律。采用主基因＋多基因混合遗传分离分析法对抗病品系04-17-3和感病品系25-1杂交组合的P1、P2、F1、F2、B1和B2共6个世代群体抗白粉病遗传进行研究。结果表明：苦瓜对白粉病的抗性遗传符合2对加性-显性-上位性主基因＋加性-显性多基因模型（E-1）,抗病对感病为不完全隐性;2对主基因的加性效应值均为-12.00;2对主基因分别具有正向部分显性和正向超显性作用,加性效应值均大于其显性效应值,上位性效应值（i＋jab＋jba＋l）为负值。从遗传率上看,回交世代和F2的主基因的值分别为55.14%、43.56%和95.22%,多基因的值分别为16.10%、26.57%和0,环境变异在4.78%~29.87%间。主基因和多基因共同决定了苦瓜对白粉病的抗性,以主基因遗传为主,同时还受到环境变异的部分影响。在白粉病抗性育种过程中,应注意利用加性效应,选用白粉病抗性基因较多的材料作为亲本,并在早代进行选择,尤其是F2代主基因选择效率最高。

全雌系苦瓜ACC氧化酶基因cDNA克隆及序列分析

为研究1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC氧化酶,ACO)基因在苦瓜性别分化中的作用,以全雌系苦瓜‘X-Hei-d-d’花蕾为试材,采用RT-PCR和RACE技术获得了ACC氧化酶基因(Mc-ACO1)的全长cDNA序列。该序列为1 137 bp(GenBank登录号:FJ459813),其完整开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量为37.30 kD,肽链N端缺失ACOs家族典型的1个保守区和2个保守二价铁离子/抗坏血酸依赖型双加氧酶氨基酸残基。序列分析表明,植物ACO基因的演化与其来源植物亲缘关系的一致性较高;与其他物种相比,苦瓜Mc-ACO1不同的氨基酸序列主要表现在肽链N端;苦瓜Mc-ACO1应属于黄瓜Cs-ACO2类成员,功能可能与性别分化相关。

苦味受体与甜味、鲜味受体具有不同的进化途径(英文)

通过生物信息学和系统发育学分析,研究了苦味受体和甜味 /鲜味受体的进化途径。结果显示,苦味受体和甜味 /鲜味受体在进化上具有远相关,并且具有不同的进化途径,提示这可能是导致这些受体具有不同功能,传导不同味觉的原因。

纯雌系苦瓜花经AgNO_3诱雄后的雄蕊发育和基因表达

为了研究AgNO3诱导下纯雌系苦瓜花蕾发育过程中的差异基因表达,本文运用形态学观察、cDNA-AFLP、RT-PCR和反向Northern杂交等技术在形态学和转录组学水平上对花蕾转雄进行了研究。结果显示:(1)花蕾在AgNO3处理后第6天出现雄蕊,第14天形成两性花,而且两性花中的花粉具有完全生活力,第22天后恢复全雌花;(2)从128对引物组合中筛选出可获得丰富清晰条带的引物组合36对,它们从AgNO3处理的花蕾中分离到11个高度表达的差异片段,经克隆、测序和在线比对,有2个未知基因,9个已知基因,其中1个与植物性别分化有关的CYP450家族基因有高度同源性,命名为McCYP72A1;(3)McCYP72A1在AgNO3处理后2～12h内的花蕾中表达,而且在第8h时表达丰度最高,但在处理的根、茎和叶以及对照的各个器官中不表达。结果表明,AgNO3处理可诱导纯雌系苦瓜花蕾中与雄性分化相关基因表达,进而可能导致处理后14天内雌花发育为两性花。

苦瓜苗期耐热性遗传规律研究

【目的】研究苦瓜苗期耐热性遗传规律,为耐热苦瓜育种及相关分子生物学研究提供理论依据。【方法】对20份苦瓜自交系进行苗期耐热性评价,以耐热苦瓜自交系‘0974’、不耐热苦瓜自交系‘1590’为亲本,构建P1、P2、F1、F2、B1和B2共6个世代遗传群体,运用植物数量性状分离分析软件研究苦瓜苗期耐热性遗传规律。【结果】苦瓜苗期耐热性的遗传是受2对加性-显性-上位性主基因控制(B-1模型),控制苦瓜苗期耐热性的2对主基因加性效应分别为-0.846 8、-0.503 3,显性效应分别为0.099 2和-0.451 7,上位性效应以显性×显性互作效应为主,主基因遗传率在B1、B2、F2世代中分别为65.71%、61.20%、71.58%。【结论】分离材料应在早期世代进行人工定向选择,选择过程中要严格控制小区环境的一致性,降低环境影响。

苦瓜叶片叶绿素响应白粉病菌侵染的遗传分析

为了探索苦瓜苗期叶片叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素响应白粉病菌侵染的遗传规律,以苦瓜高代自交系09-a与09-b为亲本构建的170个F_(2)个单株和140个F_(2:3)家系作为材料,利用植物数量遗传的主基因+多基因混合遗传模型分别对2个地点的2个群体进行基于单个分离世代群体的遗传分析。结果表明,白粉病菌胁迫下叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量均会降低,感病品系降低幅度显著大于抗病品系,降解量与病情指数呈正相关,且降解量在2个群体中均呈正态分布。F_(2)和F_(2:3)群体中叶绿素a和叶绿素b的降解量均由一对加性主基因决定,2个群体控制叶绿素a降解量的1对主基因加性效应分别为0.3151、0.1670,控制叶绿素b降解量的1对主基因加性效应分别为0.1333、0.1670。总叶绿素降解量受2对加性–显性主基因控制,2对主基因在F_(2)群体中加性效应分别为0.2601、0.3184,显性效应为-0.3452、-0.2221,在F_(2:3)群体加性效应分别为0.1892、0.1624,显性效应分别为-0.0465、-0.0897,2对主基因的加性和显性效应共同发挥着重要作用。3个性状的加性效应均为正值,且控制总叶绿素降解量的2对主基因均以加性效应为主。F_(2)和F_(2:3)群体中叶绿素a降解量主基因遗传率为76.40%、62.68%。叶绿素b降解量主基因遗传率分别为72.99%、62.86%,控制叶绿素降解量的2对主基因遗传率为65.25%、95.36%,遗传率均大于60%,表明白粉菌胁迫下叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素的降解主要受主基因的控制,但也受部分环境的影响。在苦瓜白粉病抗性育种实践中,可将叶绿素相关性状的降低量结合病情指数在早期世代进行选择。本研究为探索苦瓜白粉病抗病机理和抗病育种提供了理论依据。