绵羊皮肤成纤维细胞对G418及Blasticidin S抗性的研究

抗生素常被用于对转基因动物、植物及微生物细胞进行筛选。在进行抗生素抗性筛选前,需要摸索合适的抗生素使用浓度,其原因在于:过低的筛选浓度无法抑制非转基因细胞的生长;反之,过高的筛选浓度会导致转基因细胞死亡。为了摸索绵羊皮肤成纤维细胞(sheep skin fibroblasts, SSFs)对G418及Blasticidin S的抗性,本实验以体外培养的SSFs为实验材料,采用不同浓度的上述两种抗生素处理SSFs,采用活细胞计数的方式检测SSFs对上述两种抗生素的抗性。单独使用G418或Blasticidin S导致SSFs全部死亡的最低致死浓度分别为200μg/mL及4μg/mL;当两种抗生素联合使用时,其最低致死浓度为100μg/mL G418+3μg/mL Blasticidin S或150μg/mL G418+2μg/mL Blasticidin S。该实验为采用这两种抗生素筛选转基因SSFs提供了理论基础。

稻瘟病菌致病突变体的REMI诱变与鉴定

以水稻“爱知旭”（Ａｉｃｈｉａｓｈａｈｉ）为寄主，将带选择标记的质粒ｐＣＳＮ４３和ｐＢＦ１０１为外源ＤＮＡ，利用限制酶诱导整合（ＲＥＭＩ）这种新方法转化稻瘟病菌原生质体，从筛选到的数百个转化体中分离出３个与致病能力密切相关的突变体Ｒ２Ｈ６５、Ｒ２Ｈ６９和Ｒ２Ｂ１５６５。其中，Ｒ２Ｈ６５和Ｒ２Ｈ６９只产生畸形分生孢子，分生孢子的发育和附着胞的形成以及黑色素的合成均受到极大影响，致病性测试证明完全丧失致病能力；Ｒ２Ｂ１５６５的许多表型与野生型的相似，但致病能力却大大降低。

木荷和无患子等植物组方杀稻瘟剂的药效及其安全性

为确定所研制的植物源组方杀稻瘟剂(SSMC)的药效及其安全性,采用菌丝生长速率法和药剂喷雾法研究了该制剂的体外抗稻瘟病菌活性,体内盆栽预防和治疗作用以及田间叶、穗瘟防治效果。根据"农药登记资料要求"的规定,按照《化学农药环境安全评价试验准则》评价其环境安全性。结果显示,该制剂抑制稻瘟病菌菌丝生长的EC50为257.0 mg/L;当浓度为20 000 mg/L时,对易感水稻品种C101PKT和抗性水稻品种两优287的预防效果分别为93.3%和92.6%,治疗效果分别为90.3%和91.4%;在每667 m2用量为120、360、600 g时,对易感水稻品种深两优9152叶瘟的防效分别为13.04%、44.15%和53.68%,中、高浓度明显优于生产上使用的三环唑效果;在每667 m2用量为180、540、900 g时,对穗瘟的防效分别为18%、22.87%和43.68%。高浓度的SSMC对水稻穗瘟的防治效果接近生产上使用的三环唑效果,空瘪率显著降低,千粒重显著提高。蜜蜂、鲤鱼毒性试验结果表明,该制剂属中等以下毒性农药。由此可见,该制剂可望用于绿色水稻生产上防治稻瘟病。

亲水作用液相色谱串联质谱法测定糙米中灭瘟素残留量

建立了糙米中灭瘟素残留量的亲水作用液相色谱-质谱联用测定方法。样品用80％甲醇／水提取，经MCX固相萃取小柱净化，以WatersHPLCBEHHILIC色谱柱（100mm×2．1mm，1．7μm）分离，采用U—PLC—MS／MS多反应监测（MRM）正离子模式测定，外标法定量。灭瘟素最低检测浓度为0．02mg／kg，在0．02、0．05和0．20mg／kg3个添加水平下平均回收率为78％～95％，相对标；住偏差为2．9％～5．2％。

杀稻瘟菌素生物合成基因簇的边界确定

【目的】杀稻瘟菌素(BS)是六元糖环肽核苷类抗生素,在农业和基因工程方面有重要应用。由于在其原始产生菌中很难进行基因操作,且许多合成步骤未知,为了增加对此基因簇的认识,为后续生物合成途径的推导和改造提供更多依据,在变铅青链霉菌中确定该基因簇的边界,并对blsK基因功能进行初步研究。【方法】利用PCR-targeting法对已测序基因簇中的基因进行基因置换得到突变株,LC-MS检测突变株发酵液的产物从而确定基因置换是否影响杀稻瘟菌素的产生。【结果】明确了杀稻瘟菌素基因簇包含blsD–blsM共10个基因;在blsK的基因置换突变株中检测到去甲基杀稻瘟菌素(DBS)和少量杀稻瘟菌素的积累。【结论】blsD–blsM这10个基因负责杀稻瘟菌素的生成;从blsK的突变株产物积累结果推测,BlsK蛋白负责加载亮氨酸到DBS的精氨酸衍生侧链的β-氨基上,生成N-亮氨酰化去甲基杀稻瘟菌素(LDBS);BS生物合成途径有两条,一条是由DBS直接甲基化生成BS;另一条是由DBS转化成LDBS继而由LDBS甲基化和水解生成BS。

变铅青链霉菌体内游离胞嘧啶的发现及检测

【背景】胞嘧啶(cytosine,C)是核酸分子4种基本碱基之一。胞嘧啶首先是以胞苷三磷酸(cytosine triphosphate,CTP)的形式合成,在核酸基础代谢中没有形成游离胞嘧啶的特定途径。杀稻瘟菌素(blasticidin S,BS)和谷氏菌素生物合成途径均以游离的胞嘧啶为前体,前者的生物合成基因簇中包含一个能水解胞苷单磷酸(cytidine monophosphate,CMP)生成胞嘧啶的水解酶BlsM,后者的生物合成基因簇及其产生菌的基因组中均没有这个水解酶对应的同源蛋白。【目的】检测不同细菌中是否普遍存在游离的胞嘧啶,探究是否存在能产生游离胞嘧啶的同工酶或新途径。【方法】在BS异源表达菌株Streptomyces lividans WJ2中敲除blsM,高效液相色谱(HPLC)检测突变株和WJ2发酵产物;液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测10个经过分级纯化的微生物细胞裂解液上清中是否存在游离的胞嘧啶。【结果】突变株WJ2ΔblsM菌株仍能合成杀稻瘟菌素,但各组分产量与WJ2菌株相比均明显降低;除了变铅青链霉菌,在10株被检测的菌株中,金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)也检测到了含量较高的游离胞嘧啶。【结论】WJ2ΔblsM菌株仍具有产生BS的能力,说明野生型Streptomyceslividans菌株内存在一种未曾发现的游离胞嘧啶的产生方式,可以满足次级代谢的需求。另外,不同微生物中游离胞嘧啶的含量不同。

氨肽酶PepN1在细胞外催化杀稻瘟菌素的成熟

【背景】肽核苷类抗生素杀稻瘟菌素(BlasticidinS,BS)生物合成途径的最后一步是亮氨酰杀稻瘟菌素(Leucylblasticidin S,LBS)水解成熟为BS,BS原始产生菌灰色产色链霉菌和异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2清洗过的细胞均能催化这一步反应。前期我们确定在这两种菌中都含有编码3个氨肽酶Pep N同源蛋白的基因,其中编码产物Pep N1主要负责水解LBS和亮氨酰脱甲基杀稻瘟菌素(Leucyldemethylblasticidin S,LDBS),且催化效率相当。但是,相比于原始产生菌只积累BS这一种组分,异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2还积累了LBS和LDBS,这意味着原始产生菌与WJ2中Pep N1的水解活性存在差异。【目的】研究Pep N1在两个菌株中的表达和分泌对BS组分的影响。【方法】利用Pep N1的多克隆抗体,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)比较不同生长时间的原始产生菌和异源表达菌株在细胞内、细胞培养液中Pep N1的表达水平。硫酸铵沉淀收集两种菌株培养液中的蛋白,通过Westernblot检测Pep N1的存在并在体外检测水解活性。【结果】原始产生菌第2-6天细胞内Pep N1水平基本没有变化,而异源表达菌株自第4天起细胞内Pep N1开始减弱,到第6天完全消失;另一方面,Western blot在原始产生菌细胞培养液中检测到Pep N1,而在异源表达菌株中却没有检测到。细胞培养液水解LDBS的活性与Western blot检测到的Pep N1表达水平相一致。【结论】BS原始产生菌能持续表达合成Pep N1并将一部分Pep N1分泌到细胞外,而异源表达菌株WJ2从第4天起则停止合成Pep N1,第2-6天的细胞均不能将Pep N1分泌到细胞外,这导致WJ2中积累亮氨酰化的产物。两个菌株清洗过的细胞均可以水解LDBS和LBS,推测在WJ2体内消失的Pep N1分泌到细胞壁上但没有释放到溶液中,这部分Pep N1可以在WJ2中将部分LDBS和LBS水解成对应的DBS和BS。