包涵体中的重组蛋白经抽提后可以在变性状态下纯化,而纯化后的复性过程是基因工程下游处理的重要环节。通过对变应原Bla g 2蛋白复性前后荧光光谱的比较和分析、变性剂(尿素和SDS)对复性后Blag 2蛋白的荧光滴定实验、以及复性后Bla g 2...包涵体中的重组蛋白经抽提后可以在变性状态下纯化,而纯化后的复性过程是基因工程下游处理的重要环节。通过对变应原Bla g 2蛋白复性前后荧光光谱的比较和分析、变性剂(尿素和SDS)对复性后Blag 2蛋白的荧光滴定实验、以及复性后Bla g 2在不同pH下的荧光光谱分析,推断出Bla g 2蛋白分子在不同环境下构象的变化及其光谱学特征,初步建立了一种新的检测重组变应原蛋白变复性的光谱实验方法。展开更多
通过5'-RACE获得德国小蠊变应原Bla g 8基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,建立系统进化树,为进一步研究奠定基础。通过5'-RACE技术,PCR扩增获取编码德国小蠊变应原Bla g 8蛋白的全长c...通过5'-RACE获得德国小蠊变应原Bla g 8基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,建立系统进化树,为进一步研究奠定基础。通过5'-RACE技术,PCR扩增获取编码德国小蠊变应原Bla g 8蛋白的全长cDNA序列;采用生物信息学方法分析预测Bla g 8蛋白的信号肽、疏水性、跨膜区、二级结构、三级结构;建立系统进化树;构建原核表达载体pET32a-B8,IPTG诱导重组蛋白表达,并用His-tag抗体Western blotting验证。结果显示,获得编码德国小蠊变应原Bla g 8的全长cDNA序列,其完整阅读框含618个碱基,编码205个氨基酸。序列分析显示该蛋白,肌球蛋白轻链,具有EF手蛋白保守功能域。IPTG诱导获得重组蛋白。获得德国小蠊Bla g 8的完整cDNA序列,成功构建重组原核表达质粒pET32a-B8,并表达出融合蛋白。展开更多
目的德国小蠊(Blattella germanica)的分泌物、排泄物、蜕皮产物和尸体中携带含有大量过敏原,其中Bla g 5是引起过敏性疾病的一类重要过敏原。使用大肠杆菌克隆表达德国小蠊过敏原Bla g 5,然后使用过敏性疾病患者的血清IgE测试其变应原...目的德国小蠊(Blattella germanica)的分泌物、排泄物、蜕皮产物和尸体中携带含有大量过敏原,其中Bla g 5是引起过敏性疾病的一类重要过敏原。使用大肠杆菌克隆表达德国小蠊过敏原Bla g 5,然后使用过敏性疾病患者的血清IgE测试其变应原性。同时使用生物信息学预测Bla g 5基因的作用,了解到其分子特征。方法首先提取德国小蠊的总RNA,并根据已知的Bla g 5基因序列(GenBank:U92412)设计基因特异性引物。扩增其cDNA,并通过酶切连接构建表达载体pET-28a(+)-Bla g 5,然后转化入感受态细胞Rosetta(DE3)。选择单克隆阳性菌落进行扩增和培养。用0.1 mm/mol IPTG诱导目的蛋白的表达,然后通过金属螯合层析法纯化表达产物,并通过Western印迹法鉴定纯化产物的免疫学特性。结果对表达产物进行了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),发现可溶性表达的Bla g 5蛋白的分子量约为25 kDa,与理论结果相符。纯化的重组蛋白的免疫印迹结果表明,Bla g 5可以特异性结合过敏患者的血清IgE。基于基因序列,我们预测了Bla g 5二级和三维结构、亲水性、可塑性、抗原性、表面可及性、同源性。发现其具有典型的谷胱甘肽硫转移酶(GST)特征。结论本研究中异源表达的德国小蠊Bla g 5过敏原蛋白对过敏患者的血清具有更高的结合活性,为相应的变应性疾病的诊断试剂和疫苗的开发研究奠定了基础。展开更多
文摘包涵体中的重组蛋白经抽提后可以在变性状态下纯化,而纯化后的复性过程是基因工程下游处理的重要环节。通过对变应原Bla g 2蛋白复性前后荧光光谱的比较和分析、变性剂(尿素和SDS)对复性后Blag 2蛋白的荧光滴定实验、以及复性后Bla g 2在不同pH下的荧光光谱分析,推断出Bla g 2蛋白分子在不同环境下构象的变化及其光谱学特征,初步建立了一种新的检测重组变应原蛋白变复性的光谱实验方法。
文摘通过5'-RACE获得德国小蠊变应原Bla g 8基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,建立系统进化树,为进一步研究奠定基础。通过5'-RACE技术,PCR扩增获取编码德国小蠊变应原Bla g 8蛋白的全长cDNA序列;采用生物信息学方法分析预测Bla g 8蛋白的信号肽、疏水性、跨膜区、二级结构、三级结构;建立系统进化树;构建原核表达载体pET32a-B8,IPTG诱导重组蛋白表达,并用His-tag抗体Western blotting验证。结果显示,获得编码德国小蠊变应原Bla g 8的全长cDNA序列,其完整阅读框含618个碱基,编码205个氨基酸。序列分析显示该蛋白,肌球蛋白轻链,具有EF手蛋白保守功能域。IPTG诱导获得重组蛋白。获得德国小蠊Bla g 8的完整cDNA序列,成功构建重组原核表达质粒pET32a-B8,并表达出融合蛋白。
文摘目的德国小蠊(Blattella germanica)的分泌物、排泄物、蜕皮产物和尸体中携带含有大量过敏原,其中Bla g 5是引起过敏性疾病的一类重要过敏原。使用大肠杆菌克隆表达德国小蠊过敏原Bla g 5,然后使用过敏性疾病患者的血清IgE测试其变应原性。同时使用生物信息学预测Bla g 5基因的作用,了解到其分子特征。方法首先提取德国小蠊的总RNA,并根据已知的Bla g 5基因序列(GenBank:U92412)设计基因特异性引物。扩增其cDNA,并通过酶切连接构建表达载体pET-28a(+)-Bla g 5,然后转化入感受态细胞Rosetta(DE3)。选择单克隆阳性菌落进行扩增和培养。用0.1 mm/mol IPTG诱导目的蛋白的表达,然后通过金属螯合层析法纯化表达产物,并通过Western印迹法鉴定纯化产物的免疫学特性。结果对表达产物进行了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),发现可溶性表达的Bla g 5蛋白的分子量约为25 kDa,与理论结果相符。纯化的重组蛋白的免疫印迹结果表明,Bla g 5可以特异性结合过敏患者的血清IgE。基于基因序列,我们预测了Bla g 5二级和三维结构、亲水性、可塑性、抗原性、表面可及性、同源性。发现其具有典型的谷胱甘肽硫转移酶(GST)特征。结论本研究中异源表达的德国小蠊Bla g 5过敏原蛋白对过敏患者的血清具有更高的结合活性,为相应的变应性疾病的诊断试剂和疫苗的开发研究奠定了基础。
