产生西索米星的棘孢小单孢阻断型突变株JIM-121的筛选和研究

利用紫外光、氯化锂和甲胺复合因子处理棘孢小单孢JIM-202变株,得到一株JIM-121;其发酵液用离子交换树脂提取、然后用CM-Sephadex C-25分离表明主要含有二个抗生素即121-A和121-B。经薄层层析、红外光谱和核磁共振谱、质谱测定证实抗生素121-A与西索米星同质。根据庆大霉素-西索米星生物合成途径可推断该突变株系在西索米星到庆大霉素C_(1a)这一步转化绛红糖胺部份4′、5′还原反应较弱所致。

安普霉素生物合成途径的研究

安普霉素产生菌黑暗链霉菌 (S.tenebrarius) 1- 16经亚硝酸胍 (NTG)、硫酸二乙酯 (DES)诱变筛选获得了生物合成阻断变株。微生物转化实验结果表明 2 -脱氧链霉胺 (2 - DOS)、巴龙霉胺和安普霉胺是安普霉素生物合成的中间体。阻断变株共合成实验结果明确了各阻断变株阻断位点间的关系及上述中间体在安普霉素生物合成中的衍生次序。依据以上实验结果 ,我们提出了安普霉素可能的生物合成途径。

西索米星产生菌小单孢菌的诱变育种研究

用常规诱变育种方法对西索米星小单孢菌进行诱变育种，获得ＮＳ８－３０菌株，结合发酵条件研究，发酵效价比原始菌株提高１７倍以上，并在中试生产中应用。获得１株阻断型突变株７－２５，其代谢产物经光谱学分析鉴定为ＪＩ－２０Ａ，并对其代谢途径进行了讨论。

柔红霉素产生菌阻断突变株的筛选和鉴别

经NTG和紫外光诱变,从天蓝淡红链霉菌正定变种SIPI 1482中获得了阻断突变株N-18和U-25,通过TLC和HPLC分析,证明这两突变株的主要产物均为ε—紫红霉酮,这表明它们都在生物合成途径的中间步骤被阻断。

硫霉素生物合成酶基因克隆的研究

利用NTG诱变从硫霉素产生菌中获得了生物合成阻断变株Y_3。通过对Y_3变株原生质体形成、再生条件及DNA转化的研究,初步建立了以变株为受体的克隆系统,以pIJ680为载体,从硫霉素产生菌S.cattleya中鸟枪克隆,获得了能使Y_3变株恢复产生硫霉素的酶基因。根据对Y_3积累的中间产物的分析,认为该酶基因可能与硫霉素生物合成过程中肽的环化作用有关。重组质粒分子大小为9.8kb左右,插入片段大小为4.5kb,分子杂交试验证明插入片段来源于硫霉素产生菌S.cattleya。

武夷菌素产生菌阻断突变株的筛选及分析

以不吸水链霉菌武夷变种Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis为出发菌株,分别用亚硝基胍、氯化锂、微波为单一诱变剂,亚硝基胍和氯化锂为复合诱变剂进行处理,从亚硝基胍处理的菌株中筛选到1株丧失抑菌活性且性状稳定的突变株N1。突变株孢子丝为长螺旋形,孢子呈椭圆形,与出发菌株相比,在形态上没有显著变化且产孢量无变化。突变株的抑菌活性发生了显著变化,对所有8种供试菌株均无抑制作用。HPLC结果显示与出发菌株不同,突变株中抗生素的特征峰消失。本研究为今后开展武夷菌素合成途径和生物合成基因研究奠定基础。

牲畜链霉菌（Streptomyces cattleya）thienamycin合成阻断变株的筛选、阻断部位的确定及变株原生质体的研究

以ｔｈｉｅｎａｍｙｃｉｎ（ＴＮＭ）产生菌Ｓ．ｃａｔｔｌｅｙａ为出发菌株，利用终浓度为１．５ｍｇ／ｍｌ强诱变剂亚硝基胍在ｐＨ９．０、３７℃条件下对其孢子悬液处理３０ｍｉｎ，得到稳定的ＴＮＭ生物合成阻断变株Ｙ＿３。纸层析后进行茚三酮显迹和生物显迹表明Ｙ＿３变株积累一种无活性中间产物，其迁移率不同于ＴＮＭ。建立了Ｙ＿３变株中间产物的分离纯化方法。酸水解和氨基酸组分分析表明Ｙ＿３中间产物为谷氨酸和丙氨酸组成的二肽，可能是形成碳青霉烯双环母核的底物，提示丙氨酸可能也是ＴＮＭ的前体，Ｙ＿３变株阻断在形成碳青霉烯双环母核的环化步骤。Ｙ＿３变株具有较高的原生质体形成率和再生率。原生质体在４０℃进行处理可以在不影响再生率的前题下提高ＤＮＡ转化率。通过以上研究建立了以Ｙ＿３变株为宿主的ＴＮＭ环化酶基因克隆受体系统。

小麦突变体返白系返白阶段叶绿素代谢的变化

小麦 ( Triticum aestivum)返白系在返白阶段 Chl、胡萝卜素 ( Caro)含量均下降 ,但 Caro/ Chl的比值大于对照 ,表明叶片白化不是因 Caro减少引起的。Chl下降的同时 ,Chla和 Chlb均下降 ,表明该突变体属阶段性缺总 Chl型。返白初期 Chlase活性增高 ,返白中期活性下降 ,表明 Chl降解不是造成叶片失绿的主要原因 ;Chl合成中间物 δ-氨基酮戊酸 ( ALA)、胆色素原 ( PBG)积累 ,尿卟啉 ( Uro )、原卟啉 ( Proto )、镁 -卟啉 ( Mg- Proto )、原叶绿素酸 Pchl减少 ,特别是 Uro 在返白中期含量最低 ,复绿初期却急剧积累 ,表明叶绿素合成受阻于尿卟啉原 ( Urogen )的形成上。

吉它霉素产生菌阻断突变株的筛选

吉它霉素产生菌ＳＫ４－２经亚硝基胍诱变处理，经过分离培养和多次筛选，获得了吉它霉素生物合成阻断的突变株，用生物发酵测定，化学薄层分析及生理特性分析测定，确定了突变株的吉它霉素的生物合成途径被阻遏，从而失去了产生抗生素的能力．

无抗菌活性株及其变株的初步鉴定

对天然无抗菌活性的菌株Ｎｏ．１２和其变株Ｎｏ１２－１０３的菌体形态、培养特征及细胞壁组成作了初步分析，鉴定结果均属拟诺卡氏菌。同时对激活株的抗菌谱作了研究。并以Ｎｏ１２－１０３为出发株，诱变后选出６支阻断株，经共合成试验发现其中两株（Ｂ１，Ｂ３）可以共同合成抗生素，其余４株无此特性。而原株Ｎｏ１２和两阻断株Ｂ１、Ｂ３也能共同合成和Ｎｏ１２－１０３分泌的同种抗生素，证明在原始天然无活性株Ｎｏ１２中确实存在一条合成该种抗生素的途径。

温度对水稻突变体W1叶色及叶绿素生物合成的影响

本文研究了温度对水稻突变体W1叶色及叶绿素 (Chl)生物合成的影响。W1是温敏型叶色突变体 ,叶色转变的临界温度约为 2 3℃。在高温下 ,突变体W1的Chl和类胡萝卜素 (Caro)含量与对照无显著的差异 ,幼苗呈绿色 ;低温 (1 5～ 2 0℃ )下W1的Chl和类胡萝卜素 (Caro)含量明显较低 ,表现白化。突变体W1白化苗中的Chla和Chlb含量同时下降 ,Caro Chl的比值增大 ,说明该突变体属于不是由Caro降低而导致的总叶绿素缺陷型。白化苗中Chl生物合成的中间产物原叶绿素 (酸 ) (Pchl)、镁原卟啉 (Mg proto)、原卟啉IX(ProtoIX)含量减少 ,而δ 氨基酮戊酸 (ALA)和胆色素原(PBG)大量积累 。

新型抗肿瘤抗生素C1027生物合成相关基因克隆的研究

Ｃ１０２７是由球孢链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｌｏｂｉｓｐａｒｕｓ）Ｃ１０２７产生的一种新型大分子肽类抗肿瘤抗生素。以ｐＩＪ７０２为载体，变青链霉菌（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ５４为宿主，建立球孢链霉菌Ｃ１０２７总ＤＮＡ的随机克隆文库。以Ｃ１０２７阻断变株ＡＦ４０和ＡＦ４４为互补对象，分别与随机克隆文库中的重组菌株进行共培养，经过抗菌和抗瘤活性检测，发现重组菌株Ｎｏ．２８与阻断变株ＡＦ４４，重组菌株Ｎｏ．７４、Ｎｏ．１０１与阻断变株ＡＦ４０分别进行共培养能恢复变株的生物活性，并且ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示：变株辅基蛋白的分泌得以恢复，证明重组质粒ｐＩＪ２８、ｐＩＪ７４和ｐＩＪ１０１所含插入片段与Ｃ１０２７生物合成相关。重组菌株Ｎｏ．７４和阻断变株ＡＦ４０的共培养产物经纯化以后。

突变生物合成在微生物药物领域的研究进展

突变生物合成作为产生抗生素衍生物的重要手段,自20世纪70年代兴起以来,发挥了巨大作用,已开发出许多至今在临床上仍广泛使用的抗生素品种。随着基因技术的发展,突变生物合成技术可直接对次级代谢途径中一特定酶基因进行改造获得突变株,大大提高了工作效率和准确性。本文综述了突变生物合成技术在微生物药物领域的应用,特别是结合基因技术进行突变生物合成研究的新进展。

新型融合蛋白pro-SIRPα的构建及体外活性研究

筛选获得肿瘤特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα并对其体外活性进行了研究。首先利用噬菌体表面展示肽库筛选能与信号调节蛋白SIRPα-cv1活性区结合的短肽,并以含有尿激酶(uPA)酶切位点的linker将其连接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端,构建完整的pro-SIRPα。通过竞争ELISA实验验证pro-SIRPα前端封闭肽具有封闭效应。由于氨基端封闭肽的存在,pro-SIRPα与CD47的结合能力显著下降。而肿瘤微环境中富含uPA,可水解pro-SIRPα氨基末端的linker,使得封闭肽解离并暴露出的完整SIRPα-cv1,恢复与CD47的结合能力。因此,pro-SIRPα可特异性作用于肿瘤细胞,减少了与正常血液系统细胞的非特异性结合,降低了毒性以及可能引起的抗原沉默(antigen sink effect)现象。我们的体外实验还证实,与单独应用抗EGFR-IgG1单抗相比,pro-SIRPα与抗EGFR-IgG1单抗联用可显著增强巨噬细胞对A431肿瘤细胞的吞噬作用。pro-SIRPα的研制可能为肿瘤靶向治疗提供新的策略。