荧光偏振技术研究Bloom解旋酶催化核心与双链DNA的相互作用

Bloom综合症(BLM)解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要的作用.BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合症,患者遗传不稳定易患多种类型癌症.本研究运用荧光偏振技术研究BLM解旋酶催化核心(BLM642～1290)与双链DNA(dsDNA)的相互作用,分析其相关特征参数,了解BLM642～1290解旋酶与dsDNA的结合和解链特性.结果表明:BLM642～1290解旋酶与dsDNA的结合和解链与dsDNA 3′端的单链DNA(ssDNA)长度有关;解旋酶优先结合于dsDNA底物的ssDNA末端,且每分子解旋酶可结合9.6 nt的ssDNA;dsDNA 3′端ssDNA的长度为9.6 nt时,解旋酶的解链效率达到最大且不再随其长度而变化.另外,BLM642～1290解旋酶也能够结合和解链钝末端dsDNA,但其结合亲和力和解链效率低于有3′端ssDNA的dsDNA.推测BLM642～1290解旋酶在与dsDNA底物结合和解链时是单体形式,可能以尺蠖的形式解开dsDNA.这些结果可为进一步研究BLM解旋酶的功能特征提供理论基础.

二氢杨梅素对Bloom解旋酶结构和生物学活性的影响

目的二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY),是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗肿瘤等作用,研究DMY对Bloom解旋酶(Bloom helicase,BLM)生物学活性的影响对探索DMY的抗肿瘤机制具有重要意义。方法采用紫外光谱、圆二色谱、荧光偏振和自由磷检测等方法和技术研究DMY对BLM解旋酶的生物学活性的影响。结果圆二色谱和紫外光谱结果显示,DMY能与BLM解旋酶结合,且有1个结合位点;在0~25μmol·L^-1浓度范围内,DMY对BLM解旋酶的二级结构的干扰能力成正相关,在25~75μmol·L^-1浓度范围内则相反。荧光偏振和自由磷检测实验显示,DMY能结合在BLM解旋酶上,进而抑制BLM解旋酶的解链活性。结论DMY能够竞争性结合于BLM解旋酶的DNA结合位点上,改变BLM解旋酶的空间结构,从而抑制BLM解旋酶与DNA的结合,进而抑制BLM解旋酶的生物学活性。

Bloom解旋酶基因RNA干扰载体对前列腺癌PC3细胞的抑制作用

目的采用RNA干扰(RNAi)技术抑制前列腺癌PC3细胞系中Bloom解旋酶基因的表达,探讨Bloom解旋酶基因表达下调后对PC3细胞的抑制作用。方法使用实验室前期成功构建的两条针对于Bloom解旋酶基因的RNAi载体shRNA-1和shRNA-2转染前列腺癌PC3细胞,以未转染RNAi载体为对照组,分别在转染24、48、72h后通过MTT法检测细胞增殖情况,转染48h后通过Transwell小室法检验细胞侵袭、迁移能力,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Hoechst/PI双染法检测细胞凋亡情况。结果转染RNAi载体后,与未转染对照组相比,各实验时间点的转染组细胞增殖率降低(P<0.05),Transwell细胞侵袭和迁移实验中穿过室膜的细胞数与对照组比均减少(侵袭:119±24、118±30vs 227±38;迁移:122±13、121±47vs 277±32,P<0.05),划痕愈合率与划痕迁移距离均降低,48h时差异有统计学意义(P<0.05),而且细胞凋亡明显增加。结论以RNAi载体干扰Bloom解旋酶基因的表达可抑制前列腺癌PC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力并促进其凋亡,为前列腺癌的靶向基因治疗提供了依据。

汉防己甲素衍生物HL-49对Bloom DNA解旋酶生物学特性的影响

目的汉防己甲素衍生物是一类双苄基异喹啉类化合物,具有明显的抗肿瘤活性。研究汉防己甲素衍生物HL-49对Bloom DNA解旋酶(bloom DNA helicase,BLM)构象和生物学活性的影响对于探索其抗肿瘤作用机制具有重要意义。方法采用紫外光谱扫描研究药物HL-49对BLM DNA解旋酶构象的影响,荧光偏振技术和孔雀绿-磷钼酸铵比色法分析HL-49对BLM解旋酶的DNA结合活性、DNA解链活性、ATPase活性。结果紫外光谱扫描结果显示,HL-49对BLM DNA解旋酶的三维构象影响不明显。荧光偏振法结果显示,HL-49对BLM解旋酶的DNA(dsDNA/ssDNA)结合活性的影响不明显,但随浓度的增加,与DNA相互结合的能力越强(P<0.01)。随着HL-49浓度的增加,BLM DNA解旋酶的DNA解链能力下降,K_(obs)值逐渐降低。孔雀绿-磷钼酸铵比色结果说明,随着HL-49浓度的增加或作用时间延长,HL-49能明显抑制BLM DNA解旋酶的ATPase活性。结论汉防己甲素衍生物HL-49通过与DNA的可逆性结合,抑制BLM DNA解旋酶的ATPase活性和DNA解链活性。

人前列腺癌PC3细胞Bloom解旋酶基因干扰载体的构建

通过RNAi技术干扰人前列腺癌PC3细胞Bloom(BLM)解旋酶基因的表达。实验前期根据BLM解旋酶基因序列设计并合成两对sh RNA,插入到CMV-cop GFP-T2A-Puro-H1-mcs载体,构建针对BLM解旋酶基因的重组干扰载体CMV-cop GFP-T2A-Puro-H1-mcs-BLM1、CMV-cop GFPT2A-Puro-H1-mcs-BLM2。经测序载体构建成功后,用脂质体将所构建的载体及阴性对照载体转染前列腺癌PC3细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测转染细胞的BLM解旋酶表达情况。检测结果显示,成功构建了BLM解旋酶RNAi真核表达载体;利用脂质体转染PC3细胞后,荧光定量PCR和Western blot鉴定结果表明,BLM解旋酶的表达水平显著降低,即Bloom RNAi真核表达载体在m RNA和蛋白质水平阻断了BLM解旋酶的表达。

敲减Bloom综合征解旋酶基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探究膀胱癌细胞Bloom综合征解旋酶(BLM)表达水平及其临床意义。方法在GEPIA数据库检索BLM在膀胱癌中的表达水平,并在膀胱癌细胞系T24和人正常膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中检测BLM表达水平;转染T24细胞sh-NC和sh-BLM,未转染细胞作为对照;检测T24细胞增殖和凋亡水平。结果与非BLCA组比较,膀胱癌组织和细胞系T24细胞中BLM表达水平均上调(P<0.01)。与对照组比较,T24+sh-BLM组T24细胞BLM mRNA表达水平降低,增殖能力下降,凋亡水平升高(P<0.01)。结论在膀胱癌中BLM基因表达升高,与膀胱癌疾病进程相关,敲低其表达可抑制细胞增殖、促进凋亡。

用全内反射瞬逝场照明磁镊研究Bloom解旋G-四联体

G-四联体(G-quadruplex,G4)是广泛存在于细胞基因组中的一种DNA结构,在DNA的代谢如复制、转录、同源重组等过程中起重要作用.G4解旋酶近年来受到广泛研究,其中Bloom(BLM)解旋酶的研究已经相当丰富,但仍有一些基本问题不清楚.我们应用全内反射瞬逝场照明磁镊对BLM解旋G4的动力学过程进行了深入研究,观察到了BLM解旋G4的分步过程.相对于单分子荧光共振能量转移技术而言,借助磁镊的长时间观测性能,我们在近饱和三磷酸腺苷(ATP)浓度的实验体系中观察到BLM长时间反复解开G4或者长时间维持G4于打开状态的两种作用方式.最后,使用相同的实验条件做了单分子荧光共振能量转移实验,确定了加载2-3 pN的外力对BLM解旋G4没有显著影响.

甘草次酸下调Bloom综合征解旋酶的表达及PC3细胞的增殖凋亡和侵袭迁移

目的在甘草次酸处理前列腺癌细胞(PC3细胞)的基础上,检测细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡及Bloom综合征(BLM)解旋酶和细胞凋亡因子Caspase-3的表达。方法通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Transwell小室、划痕法检和Hoechst/PI双染分别检测细胞的增殖能力、侵袭能力、迁移能力和凋亡率;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western-blot分别检测检测BLM和Caspase-3基因的转录和蛋白表达。结果 MTT法表明,甘草次酸浓度在0.12 mol·L^(-1)以下时,对细胞的增殖能力没有影响,大于0.12 mol·L^(-1)时,随着药物浓度的增大,细胞的增殖能力逐渐下降;侵袭和划痕表明,甘草次酸浓度在0.16 mol·L^(-1)以上时,细胞的侵袭和迁移能力均显著减小;Hoechst/PI双染显示,甘草次酸浓度在0.12 mol·L^(-1)以上时,细胞发生明显的凋亡;荧光定量PCR表明,甘草次酸浓度在0.12 mol·L^(-1)以上时,随着浓度的增大,PC3细胞中的BLM基因的mRNA的表达量逐渐下降,而Caspase-3基因的表达量逐渐上升;Western blot表明,甘草次酸浓度在0.12 mol·L^(-1)时,BLM解旋酶的表达量明显降低,而Caspase-3蛋白的表达量明显升高。结论甘草次酸抑制PC3细胞的增殖、侵袭和迁移与BLM解旋酶的低表达有关,而甘草次酸促进PC3细胞发生凋亡与细胞凋亡因子Caspase-3高表达有关。

分子标记物BLM联合超声在乳腺癌诊断中的价值研究

目的探讨分子标记物Bloom解旋酶(BLM)联合超声在乳腺癌诊断及靶向BLM治疗中的价值。方法选择40例乳腺癌患者作为观察组,40例乳腺良性肿瘤患者作为对照组。比较两组血清BLM蛋白和BLM-mRNA水平。根据超声结果对患者进行BI-RADS分级,分析BI-RADS分级与血清BLM蛋白水平相关性。分析超声、BLM蛋白单独及联合诊断乳腺癌的价值。结果与对照组相比,观察组血清BLM蛋白和BLM-mRNA水平明显上升(均P<0.05)。超声联合BLM蛋白诊断的符合率、特异度、敏感度、阴性预测值、阳性预测值、约登系数和AUC值均高于各项单独检测。BI-RADS分级与血清BLM蛋白水平呈正相关性(r=0.9081,P<0.05)。结论乳腺癌患者的血清BLM水平异常上升,超声联合血清BLM检测乳腺癌具有较高临床价值。

乳腺癌缺失因子1(DBC1)影响乳腺癌细胞系对依托泊苷的敏感性

目的研究比较三阴性人乳腺癌细胞系HCC-70和MDA-MB-231中的乳腺癌缺失因子1(DBC1)对DNA损伤试剂的敏感性。方法首先通过慢病毒感染构建DBC1敲低的HCC-70细胞株,使用依托泊苷(etoposide)诱导DNA损伤;通过Western blot检测DNA损伤修复蛋白和细胞周期调控蛋白的表达;CCK8法检测细胞存活率;流式细胞测量技术检测细胞凋亡率。结果HCC-70细胞在etoposide诱导刺激下,细胞存活率和细胞凋亡水平的变化没有统计学意义,而MDA-MB-231细胞的存活率显著降低(P<0.001),细胞凋亡水平显著升高(P<0.001);HCC-70和MDA-MB-231细胞中DBC1和Bloom综合征(BLM)蛋白表达水平呈负相关;将HCC-70细胞中的DBC1敲低至接近MDA-MB-231细胞水平后,在etoposide刺激下,BLM、p21水平、细胞的存活率(P<0.001)和细胞凋亡率(P<0.01)均与MDA-MB-231细胞的结果相似;BLM的抑制剂ML216与etoposide联合使用导致MDA-MB-231细胞存活率显著降低(P<0.01),细胞凋亡显著增加(P<0.01)。结论DBC1能够影响乳腺癌细胞对DNA损伤试剂etoposide的敏感性;ML216能够增加etoposide对DBC1低表达的乳腺癌细胞的敏感性。

BLM解旋酶和TIDC在结肠癌组织中的表达及其与患者术后预后的关系研究

目的探讨Bloom综合征(Bloom syndrome,BLM)解旋酶和肿瘤浸润性树突状细胞(tumor infiltrating dendritic cells,TIDC)在结肠癌组织中的表达及其与患者术后预后之间的关系。方法回顾性选取2014年6月至2016年8月期间于大连大学附属新华医院行手术切除的168例结肠癌患者作为研究对象,获取病理科存档的手术切除的结肠癌组织以及癌旁组织标本,采用免疫组织化学染色法检测结肠癌组织以及癌旁组织中BLM解旋酶的表达及TIDC密度。采用Pearson相关分析探索BLM解旋酶表达与TIDC密度之间的相关性,采用χ2检验或秩和检验分析二者表达与结肠癌临床病理特征的关系;采用Cox比例风险回归模型分析结肠癌患者术后生存的影响因素。结果结肠癌组织中BLM解旋酶的相对表达量高于癌旁组织(1.49±0.33比1.02±0.17),TIDC密度低于癌旁组织[(9.53±2.36)%比(12.36±2.37)%],其差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,BLM解旋酶的表达与TIDC密度呈负相关关系(r=–0.588,P<0.05)。BLM解旋酶的表达和TIDC密度与肿瘤分化程度、临床分期及淋巴结转移具有相关性(P<0.05),即BLM解旋酶高表达和TIDC低密度者的肿瘤分化程度低、临床分级晚、淋巴结转移比例高。168例患者均获随访,随访时间16~60个月,中位随访时间45个月,随访期间有63例患者死亡(37.5%)。log-rank分析结果显示,BLM解旋酶低表达组的5年累积生存率高于高表达组,TIDC低密度组的5年累积生存率低于高密度组,其差异均有统计学意义(P<0.05)。Cox比例风险回归模型分析结果显示,BLM解旋酶高表达、TIDC低密度、肿瘤分化程度低、分期晚和伴淋巴结转移是影响结肠癌患者术后生存的危险因素(P<0.05)。结论结肠癌组织中BLM解旋酶表达和TIDC密度的异常,与肿瘤分化程度和淋巴结转移相关,是影响结肠癌患者远期生存的危险因素。