人肠道病毒71型类病毒颗粒在家蚕BmN细胞及幼虫体内的表达

人肠道病毒71型（human enterovirus 71,EV71）是近年来暴发危害较严重的手足口病的病原。利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕卵巢培养细胞（Bm N）中共表达EV71病毒衣壳蛋白VP1与VP2,分析二者组装成病毒样颗粒（VLPs）的效率,比较用不同启动子构建重组病毒的表达效果,并利用家蚕幼虫进行2种蛋白质的共表达及VLPs纯化条件的研究。结果表明,重组病毒v Bm Bac-vp1-vp2与v Bm Bac-vp1-IRES-vp2均可介导EV71的VP1、VP2蛋白在Bm N细胞中表达,并能够组装成病毒样颗粒,但采用Pph及Pp10启动子的表达和组装效率明显高于Pph及IRES启动子组合;将重组病毒v Bm Bac-vp1-vp2以1×10^4TCID50/头的剂量注射5龄起蚕,Western blotting检测到VP1在幼虫血淋巴中特异性表达,并且随着感染时间的延长表达量增加;经蔗糖梯度密度离心能够有效地纯化蚕体血淋巴中的病毒样颗粒。研究结果为后续EV71疫苗研制奠定了一定的试验基础。

His-猪生长激素融合基因在Bm-N细胞和蚕体内的表达与纯化

用构建的带有His-Tag pgh融合基因的重组杆状病毒Bm-BacPAK6-pgh研究了Bm-BacPAK6- pgh在家蚕细胞(Bm-N)和蚕体内的表达,并对蚕体表达产物进行了纯化.SDS-PAGE电泳分析显示,重组病毒Bm-BacPAK6-pgh在Bm-N细胞、蚕体中得到了融合表达,Wemrn blot分析表明,Bm-N细胞、蚕体中表达的融合蛋白与大肠杆菌表达的猪生长激素具有相同的抗原性.Bm-BacPAK6-pgh在Bm-N细胞内的表达始于24h,而蚕体中的表达始于72h,二者的表达峰分别在96h和120h.经40%饱和度硫酸铵盐析和Ni -NTA Agarose亲和柱二步纯化可获得SDS-PAGE电泳纯的具有抗原性的重组猪生长激素融合蛋白.

抗BmNPV即刻早期蛋白三联ribozyme在家蚕细胞中的表达

为了阻断家蚕核多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）的基因表达，以ＢｍＮＰＶ的即刻早期蛋白基因（ＩＥ）为靶序列，设计了三联ｒｉｂｏｚｙｍｅ．体外切割反应表明，该ｒｉｂｏｚｙｍｅ能特异地切割靶序列的ｍＲＮＡ；细胞实验表明，细胞中表达的ｒｉｂｏｚｙｍｅ也能够特异地切割靶序列，从而使受ＢｍＮＰＶ感染的Ｂｍ－Ｎ细胞中的多角体减少约３０％．

家蚕细胞cyclinA基因的干涉对家蚕细胞增殖的影响

[目的]研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对家蚕卵巢细胞系(Bm N)细胞cyclin A基因表达及细胞周期的影响。[方法]通过脂质体转染试剂将针对cyclin A基因的特异性siRNA片段转入家蚕Bm N细胞,采用SYBR荧光定量PCR法检测cyclin A mRNA的表达,流式细胞技术检测细胞周期变化。[结果]转染siRNA-cyclin A可有效下调cyclin A基因的表达,转染48 h后,cyclin A mRNA表达量降低到对照的37.4%;流式细胞仪分析表明:与对照组相比,转染组G0/G1期细胞比例显著增加,细胞周期阻滞于G1期。[结论]靶向cyclin A基因的siRNA片段,通过下调cyclin A基因表达能有效抑制细胞增殖。

Ribozyme对NPV感染家蚕细胞的保护作用

用自行设计的能专一切割家蚕核多角体病毒即刻早期蛋白（BmNPVIE）mRNA上三个位点的三联体ribozyme－R426（由R47，R208和R687三个ribozyme串联而成），构建了在家蚕细胞中瞬时表达的质粒pGL2Rz。为了检测和筛选的方便，在BmNPVIE启动子和R426之间装入了荧光素酶基因。细胞实验的结果表明，Bm－N细胞转染36小时，荧光素酶基因的表达已达最高峰；细胞中抽提的R426的体外切割反应表明，单体R47和R208具有切割活性，而检测不出R687的切割条带。与体外转录的R426比较，细胞中抽提出的R426的活性明显降低。对表达R426的细胞进行野生型病毒BmNPV的感染实验表明，与仅表达荧光素酶基因的对照比较，细胞中形成的多角体减少约30％。

人类免疫缺陷病毒HIV结构蛋白Gag在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

人类免疫缺陷病毒(HIV)是导致艾滋病的主要病原之一,HIV病毒的核心结构蛋白Gag有自我装配功能,并能激发体液免疫和细胞免疫,是理想的HIV疫苗靶抗原。将Gag基因克隆至质粒p Bac PAK8中构建重组质粒,并与线性化的家蚕杆状病毒基因组DNA共转染Bm N细胞,得到重组家蚕杆状病毒Bm NPV-Gag。将该重组病毒感染Bm N细胞和家蚕5龄幼虫,SDS-PAGE、Western blotting检测显示在重组病毒感染的Bm N细胞和家蚕5龄幼虫血淋巴中均有与Gag蛋白大小(55 k D)相符的特异性条带出现,证明重组Gag蛋白成功表达。用ELISA法测定重组病毒感染后不同时间目的蛋白质的表达变化:Bm N细胞中的Gag蛋白含量在感染后的第4天达到最大值6.995 pg/个,在感染第5天后出现下降趋势;5龄幼虫血淋巴中的Gag蛋白含量在感染后的第7天最高,为790.1 ng/m L。重组Gag蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达,为艾滋病疫苗的研究探索了新的途径。