家蚕核型多角体病毒对小鼠的易感性及其蛋白组份的检测

家蚕核型多角体病毒(Bm-NPV)是一类环状DNA病毒。该病毒作为载体,应用在杆状病毒-昆虫真核生物表达系统。为确定家蚕基因工程表达系统产品对人的安全性,观察了该病毒对哺乳动物细胞株及对小鼠的易感性,建立了检测Bm-NPV蛋白组份的dot-ELISA方法,可用于生物表达器生产的产品中残存多角体病毒组份的检测。结果表明,芽生型多角体病毒(BV)在杂交瘤细胞和HL60细胞中不增殖。不同剂量包埋型多角体病毒(OV)灌胃感染小鼠,小鼠肝、肾组织切片的电镜观察及免疫组化染色未见到病毒颗粒。

家蚕基因工程表达系统的病原体检测

家蚕基因工程表达系统（BmNPV）是在真核生物整体水平进行的外源基因表达系统，必须对其安全性进行研究，以确保该表达系统及其产品对人的安全。本室工作人员用PCR扩增技术及细菌培养方法对家蚕的多种成份进行了人类常见病原菌及病毒和支原体的检测，结果表明，家蚕的多种成分未分离到常见的病原菌、病毒等其它病原体。除EB、HPV病毒PCR检测样本有一区带出现外，其余都为阴性。

一种新型家蚕核多角体病毒Bac to Bac系统的构建

用家蚕核型多角体病毒的全基因组DNA与AcBacmidDNA共转染家蚕BmN细胞,构建转座一穿梭载体BmBacmid。另一供体质粒以转座方式将乙肝病毒e抗原基因HBeAg整合到BmBacmid的attTn7位点上成为重组rBmHBe。结果表明BmBacmid既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制,又能在家蚕BmN细胞和草地夜蛾Sf9细胞中复制,形成感染性病毒粒子。Southernblotting证实重组病毒的构建是正确的。BmN细胞能正确识别与切割HBeAg信号肽序列,SDSPAGE表明HBeAg基因在家蚕细胞中高效表达,ELISA测定培养上清中HBeAg效价达1∶32000,细胞内HBeAg效价为1∶2000,培养液及细胞内的HBcAg含量极低(〈1∶160)。

家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

【目的】建立针对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测技术,为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持。【方法】以Bm NPV多角体蛋白基因polh为扩增靶标,分别设计5组内/外引物和5条环引物,根据扩增效率筛选最佳引物组合;优化LAMP反应条件,并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验;使用羟基萘酚蓝(HNB)染色对结果进行比色观察,对简化样品处理的条件进行摸索。【结果】使用环引物后LAMP对Bm NPV基因组DNA的最低检测浓度为7 fg/μL,检测灵敏度得到有效提高,且反应时间缩短。建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性,对样本的检出率高于常规PCR,其最低检测限是常规PCR的100倍。在反应前加入HNB,结果易判断且能减少交叉污染。感染家蚕血淋巴进行100℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应,既简化了操作步骤,又降低了检测成本。【结论】针对Bm NPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点,适合用于生产现场的Bm NPV感染早期诊断。

家蚕核型多角体病毒GD株空斑克隆株系的建立

以家蚕胚胎细胞系(Bm E-SWU1)为病毒培养载体,利用中性红染色的方法对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)GD株进行了空斑克隆,经扩大培养,获得了GD株空斑克隆株系。根据Bm NPV CQ1株基因组序列的单核苷酸多态性(SNP)分析,选出其中SNP位点较多的gcn 2(General control nonderepressible 2)基因,用于验证BmNPVGD株空斑克隆株系的纯粹性。分别从BmNPVGD株和空斑克隆株的基因组中扩增gcn2基因,经pMD18-T克隆后测序;将两株病毒的gcn2基因分别进行SNP位点分析,发现GD株gcn2基因的潜在SNP位点有2个,而空斑克隆后的病毒株5条gcn2基因序列比较后均未发现多态性位点,说明空斑克隆株经纯化后,病原基因组的纯粹性获得了提高,病原得到了纯化。

BmMP54基因在家蚕组织的表达模式及与BmNPV多角体蛋白基因的融合表达分析

从家蚕蛹c DNA文库中筛选到一个403 bp的未知功能基因,将其命名为Bm MP54(Gen Bank登录号:DY231399.1)。该基因序列包含312 bp的开放阅读框,编码由103个氨基酸残基组成的蛋白质,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,等电点及分子质量分别为9.90和10.463 k D。将Bm MP54与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的多角体蛋白基因(Polh)融合后分别连接到原核表达载体p GEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达系统转移载体p Fast BacTMHTB中构建重组质粒,并分别在大肠埃希菌BL21(DE3)和家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中表达。原核表达的融合蛋白通过调节p H值、阴离子交换层析等纯化获得了65 k D的重组融合蛋白Polh-Bm MP54,通过Western blotting可在重组杆状病毒感染的Bm N细胞中检测到42 k D左右的Bm MP54重组蛋白,表明已按设计要求高效表达并纯化获得目的蛋白质。实时荧光定量PCR分析显示Bm MP54在家蚕5龄幼虫的气门和脂肪体组织中表达量最高,在表皮和头部的表达量最低。上述研究结果有利于后续探讨Bm MP54在家蚕生长发育过程中的生物学功能。

家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38与家蚕SRSF蛋白激酶的相互作用关系验证

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)是家蚕血液型脓病的病原,其极早期蛋白PE38参与病毒的侵染、复制与增殖。通过酵母双杂交和荧光双分子互补(Bi FC)试验证实Bm NPV PE38蛋白和家蚕SRSF蛋白激酶(Bombyx mori SRSF protein kinase 1-like,Bm SRPK)之间存在互作关系,推测Bm NPV可能是通过影响宿主的前体mRNA组成性和选择性剪接来获得对自身增殖有利的微环境。进一步利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测分析感染Bm NPV后Bm N细胞中Bm SRPK的表达变化以及正常家蚕5龄第3天幼虫体内Bm SRPK表达的组织特异性,发现感染病毒后Bm N细胞中Bm SRPK的表达量有所增加;Bm SRPK在正常幼虫的精巢、中肠和脂肪体中表达量较高,在血细胞中的表达量最低。研究结果有助于进一步深入研究Bm NPV和家蚕宿主之间复杂的相互作用关系。