Bmo-miR-375-3p对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L表达的调控作用

【目的】探究家蚕Bombyx mori miRNAs对丝素蛋白轻链基因(fibroin light chain gene,Bm FibL)和P25蛋白基因Bm P25表达的调控作用。【方法】分别以Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR为靶序列,应用在线预测软件RNAhybrid从前期家蚕4和5龄幼虫后部丝腺(posterior silk gland)sRNA高通量测序获得的29个差异表达bmo-miRNAs中,筛选对Bm Fib-L和Bm P25具有调控作用的候选bmo-miRNAs;采用半定量RT-PCR方法在mRNA水平分析候选bmo-miRNAs及其靶基因Bm Fib-L和Bm P25在4和5龄幼虫期以及5龄第3天幼虫不同组织的表达水平;利用双荧光报告基因检测系统在家蚕细胞Bm N中验证候选bmo-miRNAs对Bm Fib-L和Bm P25表达的调控作用。【结果】筛选到一个在Bm Fib-L和Bm P25 mRNA 3'UTR上都有靶位点的bmo-miR-375-3p(曾称bmo-miR-375*)。在后部丝腺中bmo-miR-375-3p和其预测靶基因Bm Fib-L和Bm P25都有较高的表达水平,提示bmo-miR-375-3p具备调控Bm Fib-L和Bm P25表达的时空条件。miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm Fib-L 3'UTR的萤火虫荧光素酶(luciferase)报告基因(luc)表达载体共转染Bm N细胞,报告基因luc的表达水平显著下降;而在miR-375-3p重组表达载体与融合了Bm P25 3'UTR的luc表达载体共转染Bm N细胞中报告基因luc的表达水平下降不显著。【结论】miR-375-3p显著下调Bm Fib-L基因的表达,而对Bm P25基因的表达无明显调控作用。

家蚕bmo-miR-0031-3p体内下调丝素轻链基因BmFib-L的表达

为了研究家蚕微RNA(microRNA, miRNA)对丝素轻链基因BmFib-L表达的调控作用,以BmFib-L mRNA的3′非翻译区(3′untranslated region, 3′UTR)为靶标,通过RNAhybrid软件分析,筛选出种子序列与BmFib-L 3′UTR完全互补的家蚕miRNA——bmo-miR-0031-3p(简称"miR-0031-3p")。分别构建miR-0031-3p表达载体pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-0031-3p-SV40]和BmFib-L 3′UTR融合萤光素酶报告基因重组表达质粒pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40],以海肾萤光素酶表达载体pRL-CMV为内参,共转染BmN细胞,通过检测双萤光素酶活性验证miR-0031-3p的功能;人工合成miR-0031-3p的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor),再进一步验证miR-0031-3p对BmFib-L的调控功能。结果显示,在BmN细胞中,miR-0031-3p显著抑制BmFib-L的表达。为了进一步验证miR-0031-3p在家蚕体内对BmFib-L表达的调控作用,在5龄第2天幼虫体腔内注射转染物,分别在体内过表达和抑制内源性miR-0031-3p,荧光定量分析靶基因表达水平。结果显示,miR-0031-3p在幼虫体内能够下调BmFib-L的表达。该研究结果有利于阐明家蚕miRNA功能和蚕丝蛋白表达调控的分子机制。

家蚕miR-0001和miR-0015体外下调BmFib-L基因的表达（英文）

目的:探究新发现的两个miRNA对家蚕丝素轻链基因BmFib-L的调控作用。创新点:在家蚕后部丝腺中发现两个新的miRNA,并首次证明它们对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L有负调控作用。方法:本实验通过生物信息学分析,从家蚕后部丝腺miRNA高通量测序获得的新miRNA中,筛选出两个可能对家蚕丝素蛋白轻链基因BmFib-L有调控作用的miRNA,即bmo-miR-0001和bmo-miR-0015。设计茎环引物,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对家蚕5龄3 d头部、表皮、脂肪体、马氏管、精巢/卵巢、丝腺(前、中、后)、气管、中肠和血淋巴细胞等12个不同组织的bmo-miR-0001和bmo-miR-00015进行半定量表达分析。并采用双荧光报告基因检测系统进一步在细胞水平上验证bmo-miR-0001和bmo-miR-0015对BmFib-L表达的调控作用。结论:本实验中RT-PCR结果显示,这两个新miRNA在家蚕后部丝腺中表达量最高(图4)。双荧光报告基因检测结果显示,报告基因荧光素酶活性明显低于阳性对照组(图7),转染bmo-miR-0001和bmo-miR-0015表达载体的细胞,报告基因和荧光素酶活性分别只及对照组60%和69%。t检验分析结果显示两个实验组与对照组之间差异都达到显著水平(P<0.05)。由此可见,bmo-miR-0001和bmo-miR-0015在体外对BmFib-L的表达具有显著的抑制作用。