^(131)I-BmK CT的制备及其在胶质瘤荷瘤大鼠体内分布与显像研究

为探索131I标记蝎氯毒素BmK CT的方法,研究标记物的稳定性、与细胞的结合能力及其在胶质瘤荷瘤Wistar大鼠体内的分布,通过克隆、表达、纯化得到多肽BmK CT,并采用Bolton-Hunter法间接标记BmK CT。胶质瘤荷瘤Wistar大鼠鼠尾静脉注射131I-BmKCT后于不同时间显像,并于不同时间处死,取血液、主要脏器及肿瘤,测定每克组织百分注射剂量率(%ID/g)。结果显示,131I-BmK CT的标记率为37.8±8.9%,放化纯>95%,其与大鼠C6脑胶质瘤细胞的最高特异性结合率为39.62%。静脉注射131I-BmK CT后24h内,大鼠血液放射性清除迅速,放射性主要聚集在肝脏、肺脏、肾脏,24h后主要积聚在肾脏并经其清除,其他组织器官的放射性随时间逐渐降低。131I-BmK CT胶质瘤荷瘤大鼠显像示肿瘤组织摄取高,肿瘤与对侧正常组织放射性计数比值(T/NT)最高可达6.79±0.29。131I-BmK CT能与C6大鼠脑胶质瘤细胞特异性结合,具有较理想的动物体内动力学表现和肿瘤摄取,有望用于脑胶质瘤的诊断和治疗,但需要进行大量研究。

^(125)I-BmK CT对胶质瘤细胞侵袭的影响

东亚钳蝎神经毒素(BmK CT)能特异性地阻断神经胶质瘤细胞的氯离子通道,抑制胶质瘤细胞的侵袭力。本文旨在研究125I-BmK CT对大鼠胶质瘤细胞(C6)侵袭的影响及作用机制。采用transwell小室评价125I-BmK CT对C6细胞侵袭能力的影响,采用酶联免疫吸附试验(ELISA法)、实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)和Western-Blot检测125I-BmK CT对C6的基质金属蛋白酶-2(MMP2)基因和蛋白表达水平的影响。实验结果表明,125I-BmK CT可显著抑制C6细胞的侵袭能力(P<0.05);显著抑制C6细胞分泌MMP2(P<0.05);C6细胞经125I-BmK CT处理后,MMP2的mRNA表达未见明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),MMP2的蛋白合成被显著抑制(P<0.05)。研究结果证明,125I-BmK CT可显著抑制C6细胞的侵袭能力,其机制可能与MMP2的分泌和蛋白合成水平降低有关。

东亚钳蝎神经毒素BmK CT三维结构分子建模及晶体生长条件的初步筛选

东亚钳蝎是一类广泛分布于我国且具有重要药用价值的野生资源。其氯离子通道神经毒素(BmK CT)对人脑神经胶质瘤细胞具有靶向特异性的抑制作用。利用SWISS-MODEL服务器对BmK CT进行蛋白质原子结构的同源建模,利用Insight Ⅱ软件包对建模结果做能量最小化和分子动力学优化,获得最佳候选模型。三维结构对比分析表明,BmKCT与以色列蝎氯通道毒素(Cltx)三维结构极为相似,均由一个α-helix和两个反向平行的β-sheet构成,但BmKCT属于βαβ型,而Cltx属于αββ型。表面静电势分析表明,BmKCT和Cltx分子表面分布着大量正电势,暗示两分子功能相似,且其中的碱性氨基酸及产生的正电势对其与受体结合起决定作用。采用晶体生长试剂盒(Crystal ScreeningKit)中的51个缓冲液配方筛选BmKCT的结晶条件,在7号配方(1.4 mol/L乙酸钠,0.1 mol/L甲次砷酸钠,pH6.51中筛选到柱状六边形晶体。

聚乙烯亚胺介导Bmk CT基因抑制C6胶质瘤细胞C-Myc、VEGF表达

目的:应用阳离子聚合物聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)介导东亚钳蝎氯离子通道毒素(Buthus martensii Karsch Chlorotoxin-like Toxin,Bmk CT)基因转染C6胶质瘤细胞,观察其对C6细胞内C-Myc、VEGF表达的影响。方法:将PEI分别和p EGFP-N1-Bmk CT、p EGFP-N1质粒混合,获得PEI/p EGFP-N1-Bmk CT和PEI/p EGFP-N1两种复合物,将其转染C6细胞,MTS法观察细胞增殖和存活活力,48 h后通过Western-blot方法检测CMyc、VEGF蛋白表达水平。结果:PEI/p EGFP-N1-Bmk CT转染C6细胞48 h后较PEI/p EGFP-N1能够显著抑制C6细胞增殖和存活活力,同时抑制C-Myc、VEGF蛋白表达。结论:PEI/p EGFP-N1-Bmk CT转染C6细胞可能通过抑制C-Myc、VEGF表达进而抑制C6细胞增殖和血管生成。

东亚钳蝎氯离子通道毒素BmK CTa在大肠杆菌中的异源表达及其对宿主菌增殖的影响

目的在大肠杆菌中异源表达东亚钳蝎氯离子通道毒素BmK CTa,并观察其对宿主菌增殖的影响。方法构建BmK CT基因原核表达质粒pExSecI-rBmK CTa,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。光密度法检测含不同质粒的大肠杆菌BL21(DE3)及空菌在37℃,LB液体培养基中的生长速率。结果重组原核表达质粒pExSecI-rBmK CTa经PCR、双酶切和测序证明构建正确。目的蛋白的表达量占全菌总蛋白的19.94%,为可溶性表达,且具有良好的反应原性。rBmK CTa的异源表达显著抑制了大肠杆菌在对数生长期的增殖。结论rBmK CTa在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,且对大肠杆菌的生长具有显著的抑制作用。提示BmK CT可能特异性地作用于宿主菌的氯离子通道,对原核生物的氯离子通道有抑制作用。

^(99m)Tc标记BmK CT及其胶质瘤荷瘤裸鼠的SPECT成像研究

目的:通过放射性核素^(99m)Tc标记BmK CT多肽制备靶向胶质瘤的显像剂,探讨^(99m)?Tc-BmK CT用于胶质瘤显像的可行性。方法:采用BmK CT多肽游离的氨基与DTPA酸酐反应得到BmK CT-DTPA,经99m Tc标记后通过柱层析分离纯化制备^(99m)?Tc-BmK CT。测定标记物在PBS溶液和血清中不同时间点放射性化学纯度,评价BmK CT-^(99m)?Tc体外稳定性。新西兰白兔耳缘静脉注射^(99m)Tc-BmK CT进行SPECT显像,观察不同时间点体内的放射性分布。皮下胶质瘤裸鼠经尾静脉注射^(99m)Tc-BmK CT,观察不同时间点肿瘤的摄取情况;注射后4 h处死裸鼠,分离肿瘤和主要器官进行离体SPECT显像,并用勾画感兴趣区法分析相对放射性计数。结果:^(99m)Tc标记BmK CT多肽标记率大于80%,经柱层析分离纯化后放射性化学纯度大于99%。标记物在PBS和血清稳定性良好,6 h内放射性化学纯度均大于95%,12 h内放射性化学纯度大于90%。正常白兔SPECT显像表明^(99m)Tc-BmK CT主要浓聚在肝脏、脾脏和肾脏,软组织持续显影微弱,甲状腺区及胃肠未见核素浓聚;显像剂主要通过泌尿系统排泄,24 h肾脏与肝脏显影接近。胶质瘤裸鼠SPECT显像表明,注射后4 h肿瘤显像清楚,ROI分析结果显示肿瘤/肌肉比4.26±0.25,标记物在肿瘤内代谢缓慢,8 h肿瘤部位仍有较高摄取。结论:本研究成功制备了^(99m)Tc标记BmK CT多肽,标记物主要被肝、脾和肾摄取,经泌尿系统排泄;^(99m)Tc-BmK CT能够在皮下胶质瘤中浓聚,注射后4 h肿瘤显影清晰,瘤内代谢缓慢,有潜力成为一种新型胶质瘤分子探针。