利用CRISPR/Cas9系统定向编辑甘蓝型油菜BnaLCR78基因

分泌信号肽是生物体内的一类重要功能分子。通过生物信息学分析,揭示甘蓝型油菜BnaLCR78基因编码一个由78个氨基酸组成、N端包含分泌信号肽且C端富含半胱氨酸的蛋白,属于富含半胱氨酸的分泌信号肽。为进一步研究该基因的功能,借助农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化方法,利用CRISPR/Cas9系统对甘蓝型油菜BnaLCR78基因进行编辑,实现定向敲除。本实验共计使用1 200个外植体,经除草剂草铵膦的抗性筛选及对213株抗性苗基因组DNA的PCR检测,获得了26株转基因油菜,转化率约为2.17%,但在T0代并未获得发生了目标基因被编辑的植株。幸运地是从T0自交获得的T1植株中获得基因被编辑了的植株。通过扩增T1代27株转基因油菜靶位点并测序,发现有1株在靶位点2有一个T碱基的插入,其基因型为+1/WT的杂合突变体,说明在T1植株中,基因的编辑效率达到了3.7%。这对后续研究甘蓝型油菜BnaLCR78基因功能的研究提供了帮助。

防御假单胞菌H78中crp基因对抗生素合成的调控作用

crp基因(编码cAMP受体蛋白)作为全局调控因子广泛存在于各种细菌中,在不同菌株中表现不同的调控功能。防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)H78能产生硝吡咯菌素(Prn)、2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)和藤黄绿菌素(Plt)等多种广谱抗生素。为探究P.protegens H78中crp基因对抗生素Prn、2,4-DAPG和Plt合成的调控作用,利用基因无痕敲除、HPLC分析、lacZ报告基因分析等技术,分析crp基因对抗生素Prn、2,4-DAPG和Plt合成及基因表达的影响。结果表明:H78菌株中crp基因的敲除导致Prn合成操纵子prnABCD表达显著下降;Plt合成及操纵子表达显著上升;2,4-DAPG合成及操纵子表达小幅下降。因此,P.protegens H78中crp基因对抗生素Prn合成存在显著的正调控作用,而对Plt合成存在明显的负调控作用,对2,4-DAPG合成存在一定的正调控作用。

人皮肤T细胞淋巴瘤系Hut-78细胞FHIT基因缺失的研究

目的 探讨抑癌基因FHIT在Hut 78细胞中的缺失情况。方法 用巢式RT PCR方法研究FHIT的缺失情况。结果 Hut 78细胞中FHIT基因mRNA比正常缩短 ,外显子 5丢失。结论 FHIT基因外显子 5的缺失可能是皮肤T细胞淋巴瘤FHIT基因失活的主要方式 。

禽大肠杆菌O_2、O_(78)菌株外膜蛋白A基因扩增及序列分析

根据Genbank中大肠杆菌K 12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物,从禽大肠杆菌O2、O78及它们的融合株O2,78(ChlrNorr)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA),进行序列测定及分析发现3个菌株的ompA均由2276nt组成,核苷酸序列完全相同,只有一个大的开放性阅读框(ORF),长1041bp,编码由346个氨基酸组成的前外膜蛋白A(pro OmpA),前21个氨基酸残基组成信号肽,成熟的OmpA由325个氨基酸残基组成,相对分子质量为37000.其氨基酸序列也完全相同.从基因水平上证明了禽大肠杆菌O2和O78菌株存在相同的外膜蛋白A抗原.

拟穴青蟹GRP78基因的克隆与应激表达

葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 ku,GRP78)是热休克蛋白70家族成员之一,在调节蛋白质折叠和维持内质网稳态过程中起着分子伴侣作用。采用RT-PCR、RACE等技术,首次从拟穴青蟹获得了GRP78的cDNA全长序列。该序列全长2 284 bp,开放阅读框(ORF)为1 962 bp,编码653个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白含有HSP70家族的签名序列,C末端为内质网蛋白滞留信号KDEL,与其他物种具有很高相似性。实时荧光定量PCR结果表明,GRP78基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达。第一期仔蟹在不同的温度和盐度下暴露12 h后,GRP78基因表达量随环境温度升高而增加;在高盐(30)条件下GRP78表达量较高,进而推测拟穴青蟹GRP78参与蛋白质折叠和环境胁迫的应答。

9-顺维A酸诱导肺癌细胞L78凋亡及其与Rb和Cyclin D_1基因表达的关系

目的 研究 9-顺维 A酸 (9- cis- retinoic acid,9- cis RA)诱导肺鳞癌细胞株 L 78凋亡作用及其与 Rb、Cy-clin D1 基因表达的关系 ,初步探讨其作用机制。 方法 体外培养肺鳞癌细胞株 L78,随机分为两组 ,实验组 :加入浓度为 5 μmol/ L 的 9- cis RA;对照组 :加入浓度为 0 .1%二甲亚砜。两组均培养 4 8小时后用免疫组织化学法检测 L78细胞中 Rb基因表达率 ,用流式细胞仪技术分别检测 Rb、Cyclin D1 基因表达率和肿瘤细胞凋亡率 ,并研究三者之间的相关关系。 结果 实验组肺鳞癌细胞株 L78细胞 Rb基因表达明显增强 ,Cyclin D1 基因表达降低 ,细胞凋亡率增高(P<0 .0 1)。 Rb基因表达率与细胞凋亡发生率呈正相关 (r=0 .85 4 ,P<0 .0 5 ) ,Cyclin D1 基因表达率与细胞凋亡发生率呈负相关 (r=- 0 .812 ,P<0 .0 5 )。 结论 9- cis RA可能通过 Rb基因表达增强和 Cyclin D1 基因表达降低途径 ,使细胞明显阻滞在 G0 / G1 期 ,并诱导肺鳞癌细胞株 L 78细胞凋亡。

基于TCGA数据库的结直肠癌差异表达基因筛选及CCDC78新基因验证

目的:通过对癌症基因组图谱(TCGA)数据库中大样本结直肠癌组织基因表达谱RNA测序(RNA-Seq)数据进行生物信息学分析,挖掘与结直肠癌预后密切相关的新基因,并对筛选出的新基因进行验证和功能研究。方法:从TCGA数据库下载结直肠癌RNA-Seq数据筛选差异表达基因,采用R-survival包对差异表达基因进行生存分析,筛选出与结直肠癌预后相关的基因,并从中挑选尚未在肿瘤研究中报道的表达上调最显著的新基因进行验证。采用RT-qPCR检测新基因在人结肠癌细胞、人正常结肠上皮细胞、人结直肠癌组织及配对的癌旁组织中表达水平的变化。采用慢病毒载体构建稳定沉默新基因表达的结肠癌细胞,以转染阴性对照慢病毒的结肠癌细胞为对照,采用CCK-8和Transwell实验研究稳定沉默新基因表达对结肠癌细胞活力、迁移和侵袭的影响。结果:(1)筛选出结直肠癌差异表达基因4 017个,Kaplan-Meier生存分析显示69个基因与结直肠癌患者预后差密切相关(P<0. 01),其中表达上调基因36个,这36个基因中有11个尚未在肿瘤研究中被报道。(2)表达上调倍数前3位的基因为CCDC78、PGGHG及TSPEAR,这3个基因的mRNA表达水平在结肠癌细胞中显著上调(P<0. 01),CCDC78 mRNA表达水平在结直肠癌组织中也显著上调(P<0. 01)。(3)稳定沉默CCDC78表达可显著抑制结肠癌细胞活力、迁移和侵袭(P<0. 01)。结论:基于TCGA数据库的生物信息学分析有助于发现与结直肠癌预后相关的新基因;CCDC78可能是一个新的与结直肠癌预后差相关的癌基因。

Grp78基因过表达慢病毒载体构建和包装及鉴定

目的探讨Grp78基因过表达慢病毒载体的构建、包装和滴度检测。方法采用慢病毒载体,运用基因工程技术,获取目的基因片段并构建重组质粒,然后制备感受态细胞并转化,将重组质粒导入感受态细胞;用PCR技术鉴定阳性克隆和进行DNA序列分析及对慢病毒包装和滴度检测。结果阳性克隆测序比对结果说明测通。熔解曲线中既没出现杂峰也没出现主峰的异常增宽,表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。结论 Grp78基因过表达慢病毒载体构建和包装成功。

油茶CYP78A10同源基因及其SSR位点

拟南芥(Arabidopsis thaliana)CYP78A亚基因家族基因参与种子大小的遗传控制。对普通油茶(Camellia oleifera)转录组数据进行挖掘,从花蕾和根转录组数据中分别得到1条CYP78A10的同源基因,再从油茶基因组三代测序数据中鉴别出其基因组DNA序列,最后,得到2条油茶CYP78A10同源基因全长CDS序列,分别命名为CoCYP78A10a、CoCYP78A10b。用植物CYP78A亚基因家族基因的蛋白质序列构建进化树,结果表明,CoCYP78A10a、CoCYP78A10b与CYP78A10、GmCYP78A10在一个分支,可能参与油茶种子大小的调控。通过SSR位点信息分析,在CoCYP78A10a第1外显子5’端非翻译区、CoCYP78A10b的启动子区分别发现1个适宜进行SSR分子标记开发的多态性位点。

水稻OsWRKY78与GFP融合基因的拟南芥转化及亚细胞定位

[目的]确定OsWRKY78蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中OsWRKY78全序列设计引物,进行OsWRKY78的RT-PCR扩增,克隆了OsWRKY78基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinGFP重组,并对重组载体进行菌液PCR和酶切验证,最后利用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥中,对其亚细胞定位进行研究。[结果]试验克隆得到了pBinGFP-OsWRKY78重组载体,经菌落PCR与酶切检测表明构建的表达载体正确,其转化到拟南芥中后得到了转基因植株,荧光显微镜检测结果表明,OsWRKY78基因表达产物主要定位在细胞核中。[结论]该研究结果为深入研究OsWRKY78基因的功能及其在相关信号传导中的作用奠定了基础,也为进一步研究OsWRKY78基因与褐飞虱之间的关系提供了理论依据。

TaCYP78A5基因过表达小麦的遗传和功能初步分析

为了验证小麦籽粒大小相关基因TaCYP78A5在小麦籽粒发育中的功能,对pINO启动子驱动的TaCYP78A5基因过表达的转基因小麦后代株系进行了鉴定,检测了T_0代植株目标基因拷贝数,定量分析了7个T_1代阳性植株的目标基因表达,并对其籽粒大小进行了统计。结果表明,利用Bar试纸条和目标基因特异PCR检测相结合的方法对21株转基因T_0代再生苗进行检测,共鉴定出14个阳性植株,除2个植株的目标基因拷贝数为3和1个植株为7外,其余11个T_0代转基因植株目标基因插入拷贝数均为1~2个,其中有6个单拷贝植株。与野生型相比,7个T_1代阳性植株目标基因表达量均极显著增加,粒厚和粒宽均有不同程度增加,粒重极显著增加。

陆地棉转录因子GhNAC78基因的特征及功能分析

本实验室从陆地棉中克隆得到GhNAC78,分析了其基因特征及功能。该基因cDNA全长为937 bp,开放阅读框为876bp,编码291个氨基酸,隶属于NAM转录因子亚家族。体外转录激活实验表明,GhNAC78具有转录激活活性。上游启动子区1537 bp序列的生物信息学分析可知其包含多种激素、胁迫和光响应元件,表明GhNAC78广泛地参与植物生长发育和胁迫响应的调控。荧光定量结果显示,GhNAC78在棉花叶片衰老过程中高调表达,推测其参与叶片衰老的调控。

葡萄糖调节蛋白78基因3'UTR多态性与男性弱精子症的相关性研究

目的:探究葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因3'UTR单核苷酸多态性(rs12009、rs1140763和rs16927997位点)与弱精子症的关系。方法:选取400例弱精子症不育男性为弱精子症组,400例有生育史的健康男性为对照组,运用多重单碱基延伸PCR(SNa Pshot)对所有研究对象GRP78基因的rs12009、rs1140763和rs16927997位点进行基因分型,再分析此3个位点多态性与男性弱精子症的相关性。结果:弱精子症组和对照组的前向运动精子百分率分别为(20.09±8.18)%、(57.16±13.45)%,两者差异具有统计学意义(P<0.01)。GRP78基因rs12009和rs1140763存在CC、CT、TT 3种基因型和C、T 2种等位基因;rs16927997存在GG、GA、AA 3种基因型和G、A 2种等位基因。在弱精子症组中,rs12009位点C、T等位基因频率分别为47.3%、52.7%;rs1140763位点C、T等位基因频率分别为52.0%、48.0%;rs16927997位点G、A等位基因频率分别为4.4%、95.6%。而在对照组中,rs12009位点C、T等位基因频率分别为44.3%、55.7%;rs1140763位点C、T等位基因频率均为50.0%;rs16927997位点G、A等位基因频率分别为6.0%、94.0%。3个位点基因型及等位基因频率在弱精子症组和对照组中的分布差异均无统计学意义(P>0.05);进一步单倍型分析,发现在弱精子症组和对照组中主要为C-C-A、T-C-G、T-T-A 3种单倍型,但也未发现单倍型与男性弱精子症存在相关性。结论:GRP78基因3'UTR多态性与男性弱精子症的发病风险不存在相关性。

Grp78基因转染肝细胞癌SMMC-7721克隆筛选及鉴定

目的用G rp78基因转染人肝细胞癌SMMC-7721,筛选阳性克隆并鉴定。方法利用真核表达载体pcDNA3.1+G rp78转染SMMC-7721,pcDNA3.1+G rp78与转染试剂的比例(μg/μL)分别为2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8、2∶9,400μg/mL G418筛选阳性克隆后,传代扩增,W estern B lot鉴定克隆的G rp78表达情况。应用pcDNA3.1空载体作为阴性对照。结果W estern B lot显示,转染后的SMMC-7721经G418筛选,除一个克隆不高表达外,其余克隆均高表达G rp78。结论G rp78转染SMMC-7721的最佳转染效率是8∶2(转染试剂/DNA),由于假阳性克隆的存在,筛选后的克隆需要鉴定。

人GRP78基因真核表达载体的构建及鉴定

目的利用PCR技术克隆人GRP78基因编码基因(约2000bp)。方法将PCR产物连接到pcDNA3.1(+)载体上,酶切鉴定后测序分析。结果序列分析表明,扩增片段与GenBank里登陆的序列同源性为100%。并以pcDNA3.1(+)表达载体为框架结构,尝试构建真核表达载体。结论测序分析结果表明序列同源性为100%。

菝葜提取物对Hut-78细胞Bcl-2基因转录水平的影响

目的探讨菝葜提取物对Hut-78细胞Bcl-2基因转录水平的影响。方法利用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定给药后各组的吸光度值,计算各组的Bcl-2/GAPDH值,从而分析Bcl-2基因转录水平的变化。结果菝葜提取物对Bcl-2基因的转录水平具有下调作用,药物浓度在8μg·mL-1时的效果最为明显。结论该菝葜提取物可降低Hut-78细胞的Bcl-2基因的转录。

不同物种snR72～snR78的比较基因组分析

采用生物信息学技术对不同物种snR72～snR78(snR72、snR73、snR74、snR75、snR76、snR77和snR78)snoRNA基因进行了比较基因组学研究。结果发现,真菌中snR72～snR78具有较高的保守性,它们串联在一起形成基因簇。但在真菌的不同种中,基因簇中的部分snoRNA发生了缺失、位移和重组。动物和植物均存在着真菌snR72～snR78基因的同源分子。但是,与真菌snR72～snR78基因簇不同,动物和植物中的真菌snR72～snR78基因的同源分子并不是串联在一起形成基因簇,而是分散在基因组的不同位点。目前,在动物中尚未发现snR72和snR75,在植物中尚未发现snR76。值得注意的是,在真菌中,snR72～snR78基因簇的各成员只有一个拷贝,但在人、动物和植物中,snR72～snR78的一些成员有多个拷贝。人和小鼠的snR73和snR76有多个拷贝,拟南芥snR72、snR75、snR77和snR78有多个拷贝,水稻snR73、snR75和snR77有多个拷贝。而且,一些多拷贝的snoRNA基因串联在一起,表明动植物中的这些多拷贝的基因很可能是在进化过程中由局部复制产生。

猪GRP78基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究

本研究旨在克隆猪葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在猪不同组织中的表达情况。根据GenBank上公布的猪GRP78基因序列(登录号:XM_001927795.6)设计引物,PCR扩增及测序获得猪GRP78基因CDS序列,使用在线软件分析GRP78的理化性质、跨膜结构、信号肽、疏水性、保守结构域、二级结构和三级结构,并进行同源性比对及系统进化树构建,利用实时荧光定量PCR方法检测猪GRP78基因在各组织中的表达情况。结果显示,猪GRP78基因CDS区长1 965bp,可编码654个氨基酸。生物信息学分析表明,GRP78理论分子质量为72.3ku,等电点(pI)为5.06,半衰期为30h,其水溶液在280nm处的消光系数为30 495,肽链N端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为32.39,属于稳定蛋白。脂肪系数为85.40,总平均疏水指数为-0.496,无跨膜结构,存在信号肽序列,说明该蛋白属于分泌型蛋白;GRP78蛋白只包含1个超家族保守结构域:HSP70结构域。蛋白二级结构分析显示,GRP78蛋白中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别为40.06%、20.49%、8.10%和31.35%。同源性比对结果显示,猪GRP78基因与人(登录号:NM_005347.4)、小鼠(登录号:NM_001163434.1)、大鼠(登录号:NM_013083.2)、山羊(登录号:XM_005687138.3)、牛(登录号:NM_001075148.1)核苷酸序列的同源性分别为93%、91%、90%、95%、95%,氨基酸序列的同源性分别为99%、98%、98%、99%、99%,各个物种之间GRP78基因保守性较高。实时荧光定量PCR结果显示,GRP78基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、卵巢、输卵管、乳腺、小脑、大脑、垂体等组织中均有表达,在心脏、脾脏、肺脏中相对高表达。本研究结果为今后深入研究GRP78基因的生物学功能提供了基础材料。

富硒酵母干预对高脂小鼠GRP78基因表达的影响

目的:探讨富硒酵母干预对高脂大鼠内质网应激基因GRP78表达的影响。方法:选取40只6周龄小鼠作为研究对象,建立高脂小鼠模型,并随机分为4组(a:对照组,b:高脂日粮组,c:高脂日粮+低剂量富硒酵母组,d:高脂日粮+高剂量富硒酵母组),观察肝脏脂肪变性程度,检测肝脏脂质氧化MDA水平和GRP78基因的mRNA表达水平。结果:高脂日粮可以诱发小鼠肝脏指数增大和脂肪变性,饲喂富硒酵母后,小鼠的肥胖和肝脏脂肪变性得到了明显改善;高脂日粮组与其他组相比肝脏中MDA和GRP78基因的表达水平显著升高,高剂量硒酵母对高脂诱发的MDA升高和GRP78基因的表达水平均有拮抗作用。结论:硒能逆转高脂小鼠的肝脏损伤,内质网应激信号通路在其中发挥了作用,该应激可能是通过提高氧化水平而诱导的。