甘蓝BobHLH121基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】克隆甘蓝b HLH转录因子(BobHLH121)基因,分析其在不同组织及低温胁迫下的表达模式,为深入研究bHLH转录因子在甘蓝低温响应中的作用机理提供理论参考。【方法】克隆BobHLH121基因编码区(CDS)序列,利用生物信息学软件进行预测分析,并构建p CAMBIA1300-FaFKF1-GFP融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白亚细胞定位情况。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BobHLH121基因在低温胁迫下的相对表达量。【结果】BobHLH121基因CDS长度为1367 bp,定位于C06染色体上,其编码311个氨基酸,蛋白分子量为34.89 kD,理论等电点(p I)为5.42,不稳定系数为52.29,疏水性平均系数为-0.733,说明该蛋白为不稳定的亲水性蛋白,且呈酸性,定位于细胞核。BobHLH121蛋白的二级结构主要由α-螺旋(占30.87%)、延伸链(占9.32%)、β-转角(占2.89%)和无规则卷曲(占56.91%)组成,具有保守的HLH结构域。BobHLH121蛋白与拟南芥(NP_191768.2)、琴叶拟南芥(EFH52923.1)、亚麻荠(XP_01909381.1)、荠菜(XP_023638997.1)、油菜(CDY65446.1)、白菜(XP_009104362.1)和萝卜(XP_018442860.1)等多种植物bHLH蛋白的氨基酸相似性分别为55.6%、54.8%、52.0%、50.3%、76.4%、73.9%和61.1%。系统发育进化树分析结果显示,BobHLH121与拟南芥(NP_191768.2)和琴叶拟南芥(EFH52923.1)bHLH蛋白在同一小分支上。BobHLH121基因启动子区域存在植物生长发育、非生物胁迫、激素应答和光响应大量的顺式作用元件。BobHLH121基因在叶片的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),在其他组织中的相对表达量均较低。低温胁迫6~12 h时BobHLH121基因的相对表达量较低温处理0 h(对照)显著降低,在低温处理24 h时急剧升高,显著高于其他处理时间,低温处理48 h时又显著降低,表明该基因可能在低温胁迫下延迟表达。【结论】BobHLH121基因含有bHLH家族典型的HLH保守结构域序列,具有明显的组织表达特异性,可能参与甘蓝叶片的生长发育调控,且响应低温胁迫,可能在甘蓝耐寒性中发挥调控作用。

柽柳再生和转化体系的建立及瞬时转化TcSYP121基因功能分析

【目的】建立柽柳再生及遗传转化体系并分析瞬时转化柳树突触融合蛋白(TcSYP121)基因功能,为筛选柽柳分子抗性育种候选基因及盐碱土的改良和生态修复提供理论参考。【方法】通过单因素筛选最佳外植体、消毒处理、各阶段(初代、分化、增殖和生根)的培养基类型及激素浓度建立柽柳再生体系;通过正交试验分析影响转化体系的4个因素(预培养时间、侵染时间、共培养时间和农杆菌浓度);通过PCR扩增及电泳结果验证柽柳转化体系;瞬时转化TcSYP121基因获得过表达植株(OE)和病毒诱导的基因沉默植株(VI),进行表型观测、植物超氧阴离子染色液(NBT)和二氨基联苯胺法(DAB)染色并测定盐腺直径和盐腺密度、叶绿素含量、超氧化物酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性及TcSYP121基因相对表达量,分析TcSYP121基因的功能。【结果】最优外植体为柽柳嫩茎段,最适宜次氯酸钠(NaClO)消毒浓度为5%,最佳消毒时间为5 min,最适合的初代培养基为MS培养基,最佳分化培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,最佳增殖培养基为MS+1.5mg/L6-BA+0.1mg/LIBA,最佳生根培养基是1/2MS+0.5mg/L IBA。转化体系中正交试验结果为最佳预培养时间是2 d,最佳侵染时间是5 min,最佳共培养时间是2 d,最佳农杆菌浓度OD600为0.8,抗生素头孢霉素(Cef)浓度为300 mg/L,卡那霉素(Kan)筛选压为30 mg/L。PCR扩增及电泳结果显示,利用该遗传转化体系可获得阳性转基因植株。瞬时转化TcSYP121基因柽柳的耐盐功能分析结果显示,在盐胁迫下,VI和对照(CK)柽柳中叶绿素含量显著下降(P<0.05),而OE下降不显著(P>0.05);OE柽柳SOD和POD活性均高于VI与CK,且OE中Tc SYP121基因的相对表达量高于CK和VI。【结论】建立了柽柳的再生体系和遗传转化体系,通过对柽柳进行瞬时转化获得过表达和沉默表达柽柳,证实TcSYP121基因能够提高柽柳耐盐性。

中国汉族人群ENPP1基因K121Q多态与2型糖尿病的关联及Meta分析

多个欧洲白人的Meta分析表明核苷酸焦磷酸酶1（Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1,ENPP1）基因K121Q多态与2型糖尿病相关联,但在日本人、韩国人和中国台湾人的研究中没有发现相关性,而在中国大陆人群中二者的关联研究结果不尽一致。文章调查了湖北地区539例2型糖尿病患者和404名正常人ENPP1基因K121Q多态性。基因型及等位基因频率在病例组和对照组间没有显著差异（P〉0.05）,但经性别、年龄和体重指数调整后的Logistic回归分析揭示XQ基因型与2型糖尿病显著相关（OR=1.5,95%CI：1.39~1.62,P〈0.001）。对性别进行的亚组分析显示,女性病例组Q等位基因和XQ基因型的频率显著高于对照组（Q：12.4%vs.6.1%,P=0.001;XQ：23.7%vs.11.7%,P=0.001）。结果表明ENPP1基因K121Q多态与湖北汉族人2型糖尿病的关联存在性别差异,在女性中更明显。文章是对中国大陆人群进行的第一个Meta分析,结果显示Q等位基因增加2型糖尿病的发病风险（OR=1.42,P=0.042）。

VEGF121和BMP2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及其在HEK293中的表达

目的构建人血管内皮生长因子121(VEGF121)与人骨形态发生蛋白2(BMP2)双基因共表达腺病毒载体Adv-BMP2-IRES-VEGF121,并观察其在人胚肾细胞株(HEK293)中的表达情况。方法对腺病毒质粒pShuttle-CMV-BMP2的目的基因BMP2进行PCR扩增。腺病毒质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn I/Xba I酶切后,将BMP2片段定向导入pShuttle-CMV-VEGF121-IRES,构建pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,并注入大肠杆菌DH5a中扩增,提取质粒。通过酶切分析、PCR检测和序列分析进行鉴定。将构建所得的质粒转染HEK293,采用RT-PCR法检测HEK293中的BMP2、VEGF121 mRNA,Western blot法检测其蛋白。结果成功构建了Adv-BMP2-IRES-VEGF121。酶切分析及DNA序列测定证实重组质粒构建正确。质粒转染后的HEK293 BMP2和VEGF121表达阳性。结论成功构建了Adv-BMP2-IRES-VEGF121,其转染HEK293后,VEGF121、BMP2在HEK293中共表达阳性。

构建携带VEGF_(121)-FLAG和hrGFP-1基因腺病毒表达载体在骨髓基质干细胞中的表达(英文)

背景:血管内皮生长因子具有促进血管生成的作用,在骨缺损的治疗研究中运用较多,但其异构体VEGF121的研究较少。目的:构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体并观测其在骨髓基质干细胞中的表达。方法:以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去除VEGF121基因中终止密码子,之后在基因序列前后分别加入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点,并将得到的基因亚克隆至pMD19-T质粒上,双酶切pMD19-T-VEGF121和pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1质粒,凝胶回收小片段和大片段,后进行连接反应,完成穿梭质粒的构建。重组病毒物理滴度测定后感染骨髓基质干细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度。结果与结论:经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的骨髓基质干细胞有明显的绿色荧光表达。可见构建的携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达,有可能用于缺血性疾患的基因治疗。

人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料修复桡骨火器性骨缺损

背景:骨缺损是导致火器性股损伤骨不连的首要原因,火器性损伤相对比较特殊。自体骨移植和异体骨移植均存在较大弊端,难以满足基层医院需求,采用具有良好血管能力、骨能力的组织工程化骨修复火器性骨缺损将是一种理想的、可行的修复方法。目的:探讨人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料在兔桡骨火器性骨缺损修复中的应用。方法:将128只家兔随机分为手术致伤组和火器伤组,每组64只。火器伤组采用56式滑膛枪发射质量为0.25 g的钢珠,建立火器伤桡骨损伤模型;手术致伤组仅用手术方法造成兔桡骨1.2 cm损伤模型。采用人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料进行修复处理,取家兔相关组织细胞,获得骨髓基质干细胞进行培养,制备多孔支架材料,并将获得的材料分别植入手术致伤组和火器伤组家兔桡骨骨缺损部位,分析人血管内皮细胞生长因子121基因修饰材料在兔桡骨火器性骨缺损修复中的应用。结果与结论:与手术致伤组相比,修复8,12,16周后,火器伤组家兔骨缺损部位灰度比值、健侧与修复侧桡骨的抗压缩力学比值降低(P<0.05),新生骨面积增多(P<0.05);修复2,4周后,骨缺损修复处局部血流量显著升高(P<0.05)。结果说明,与单纯手术致桡骨损伤相比,烧伤致桡骨损伤修复过程中由于局部出现了缺血缺氧,采用人血管内皮细胞生长因子121基因治疗效果更理想。人血管内皮细胞生长因子121能够对骨髓基质细胞进行修复,将其运用于火器烧伤中能够提高其合成及分泌成血管因子,提高其局部血流量、降低抗压缩力学比值,且新生骨面积较大。

重组人血管内皮细胞生长因子121cDNA的基因克隆、表达和鉴定

应用RT PCR方法 ,扩增人VEGF12 1cDNA基因片段 ,与酵母表达载体pPIC9K重组 ,获得表达质粒p9KVEGF12 1.该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,PCR鉴定VEGF12 1cDNA与酵母染色体整合状态 ,高拷贝转化子用甲醇诱导表达 .工程菌用 5L发酵罐发酵 ,表达产物r hVEGF12 1占培养液中总蛋白量 70 %以上 .纯化产物促进牛毛细血管内皮 (BCE)细胞增殖 。

血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景:人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2在激素性股骨头坏死骨缺损中均具有成血管成骨作用,目前国内在以人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2基因联合治疗激素性股骨头坏死方面少有报道。目的:构建人血管内皮生长因子121与人骨形态发生蛋白2双基因腺病毒穿梭质粒。方法:将质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经KpnⅠ/XbaⅠ酶切后,将BMP2片段定向连入pShuttle-CMV-VEGF121-IRES,构建可同时表达2个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-BMP2,注入H5a细胞扩增,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析及序列测定。将已构建确认正确的腺病毒质粒,经BJ5183-AD-1电转感受态细胞进行电穿孔后,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析,PCR检测和序列分析。结果与结论:酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确,提示实验成功构建了血管内皮生长121及骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体。

羊口疮病毒凤翔株ORFV121和vIL-10基因的生物信息学分析

为分析羊口疮病毒ORFV121和vIL-10基因在凤翔(FX0910)强毒株(vORFV)和弱毒株(lvORFV)之间的差异,应用PCR方法扩增羊口疮病毒ORFV121和vIL-10基因的全长序列并测序,应用生物信息学软件分析基因的核酸、氨基酸相似性,蛋白的亲水性、二级结构以及抗原性。结果显示,lvORFV的ORFV121基因118位的谷氨酸缺失,说明该处发生的碱基突变为有意突变,该突变导致弱毒株相应蛋白的亲水性、二级结构发生变化,蛋白的抗原性在很多区域发生本质改变;vIL-10在蛋白质水平出现了5个氨基酸位点突变(14:V→W,49:A→P,57:T→M,72:R→C,102:I→V)和79位插入1个色氨酸。这些位点差异导致蛋白的亲水性、二级结构和抗原性发生了变化。ORFV121基因和vIL-10基因在vORFV和lvORFV之间存在差异,这些基因差异导致蛋白的亲水性、二级结构和抗原性发生改变。

“学教练121”教学模式下的高中生物课堂教学——以《基因指导蛋白质的合成》的教学设计为例

结合 《基因指导蛋白质的合成》 一节的教学设计, 对 “学教练121” 教学模式在高中生物课堂教学中的运用策略进行具体阐述.

烟草NtSYP121基因克隆、表达载体构建及表达分析

采用同源克隆的方法对烟草品种K326中的一个SYP121基因进行了研究,该基因全长903 bp,蛋白编码300个氨基酸。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与渐窄叶烟草SYP121-like、绒毛状烟草SYP121-like等的亲缘关系最近,故命名为Nt SYP121。组织表达分析发现,该基因在成熟期的根、茎、叶、花中均有表达,在根中的表达量最高。非生物逆境胁迫实验表明,该基因对低钾、高盐、干旱、ABA均有响应表达,并成功构建了Nt SYP121-p BI121过表达载体。研究结果为解析Nt SYP121在响应逆境胁迫的功能奠定一定理论基础。

羊口疮病毒安徽株121基因的原核表达与生物信息学分析

为了对羊口疮病毒(ORFV)安徽株121基因进行原核表达及生物信息学分析。以ORFV AH-F10株为模板对121基因进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6P-1-121,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E.coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化,确定了ORFV 121重组蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE及Western-blot鉴定结果表明,重组蛋白大小约为60 ku,在Rosetta中高效表达,主要以包涵体形式存在且具有良好的反应原性。包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗氏佐剂进行乳化后皮下注射6周龄的BALB/c雌鼠。每14 d后加强免疫1次,4次后收集小鼠血清。对收集到的血清进行Western-blot特异性鉴定,该抗体血清可以和阳性原核表达的ORFV 121蛋白进行特异性反应,表明成功制备鼠源多抗血清。利用生物信息学相关软件对目的基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、磷酸化位点、二级结构和B细胞表位进行预测。结果显示该蛋白等电点为8.86,属不稳定的亲水性蛋白;预测有50个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲结构居多占62.25%,α-螺旋、β-转角、延伸链分别占27.81%,2.98%,6.95%;预测该蛋白存在8个潜在B细胞优势表位。成功表达了ORFV AH-F10121蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白结构与功能及ORFV致病机理的深入研究奠定基础。

PC-1基因K121Q多态性与2型糖尿病合并冠状动脉粥样硬化性心脏病的关系

目的观察PC-1基因K121Q多态性与2型糖尿病合并冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称2型糖尿病合并冠心病)的关系。方法选自2018年1月-2020年1月于我院医院收治的2型糖尿病合并冠心病患者120例作为观察组,健康体检者103例作为对照组。观察两组间生化学指标、基因型及等位型基因频率,并对比观察组PC-1不同基因型的血脂及血糖水平。结果对照组总胆固醇、三酰甘油、LDL-C、HbAlc、空腹血糖、cTnⅠ、apoCⅢ、BMI均低于观察组,而HDL-L则高于观察组(P<0.05);对照组KQ+QQ基因及Q等位基因低于观察组,KK、K等位基因高于观察组(P<0.05);观察组PC-1基因K121Q位点KK与KQ+QQ基因型间比较,KK基因型BMI低于KQ+QQ基因型,差异显著(P<0.05);而两基因型患者空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、LDL-C、HDL-L水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论PC-1基因K121Q多态性可能通过影响血脂、血糖代谢,进而导致2型糖尿病合并冠心病的发生。

木薯AGPase基因的克隆与载体构建

为了研究木薯淀粉合成酶关键基因AGPase在木薯淀粉合成中的作用,根据GenBank中其他物种AGPase小亚基基因序列,从高淀粉木薯‘辐选01’中克隆得到含3’末端的909bp的基因片段,回收克隆测序。结果显示,克隆获得片段与基因库中登录的蓖麻、毛果杨、甜橙、番薯、蜜柑、大豆同源性依次达到91%、91%、87%、86%、86%及85%。将阳性克隆与PBI121载体进行双酶切、连接,构建植物反义表达载体PBI121-AGPss,并将其导入农杆菌,得到农杆菌工程菌株。为进一步开展木薯淀粉合成相关的基因调控、转基因及基因功能研究奠定基础。

渗透胁迫相关基因高通量筛选技术体系的建立

随着功能基因组学的发展,在基因组水平上获得了大量渗透胁迫相关基因。农杆菌介导的超量表达是筛选和鉴定这些基因功能最为常用的技术。以植物表达载体pBI121为基础,在不改变其氨基酸序列的基础上通过定点突变消除了其上与质粒复制和稳定性有关的trfA基因(X00713)内部的SfiI酶切位点,并在表达单元CaMV35s启动子和NOS终止子之间引入了SfiIA和SfiIB位点,改造成通用植物表达载体卡盒pBHT-5。该载体卡盒可直接用于连接Clontech SMARTTM技术构建的cDNA文库,提高了大规模构建cDNA文库基因植物表达载体的工作效率。为高通量的筛选与鉴定基因功能,从大量的渗透胁迫相关基因中筛选出具有独立知识产权的、对植物抗渗透胁迫起重要作用的新基因奠定了坚实的基础。

甘蓝抗枯萎病基因FOC1植物表达载体构建及遗传转化

为研究甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的抗性功能,利用前期克隆的FOC1基因,以pBI121质粒为植物表达载体,采用同源重组法构建FOC1基因的过表达载体;将构建好的重组质粒采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株中,并通过农杆菌介导的甘蓝外植体转化法对感病甘蓝进行遗传转化,利用载体特异引物对获得的转基因植株进行PCR鉴定。结果表明,最终成功构建FOC1基因的过表达载体pBI121-35S-FOC1,并已成功整合到受体甘蓝基因组中。

东方百合“元帅”查尔酮合酶基因表达载体构建

利用Genbank中公布的东方百合"元帅"查尔酮合酶cDNA序列,从东方百合"元帅"花瓣中扩增CHS1的cDNA开放阅读框,正向插入植物表达载体pBI121,并采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌EHA105中。结果表明:经酶切和菌液PCR分析鉴定,获得与预期大小相符的1 200 bp片段,得到含有目的片段表达载体pBI121-CHS1的农杆菌菌株,可用于新铁炮百合的遗传转化。

新城疫病毒HN基因的克隆及在苜蓿中的表达

为了克隆新城疫病毒LaSota株HN基因,构建原核重组表达质粒pBI121-HN,使HN基因在苜蓿中表达,将新城疫病毒LaSota株接种于鸡胚,培养、纯化后收获鸡新城疫病毒,提取病毒RNA,经反转录后通过PCR扩增HN基因,克隆得到重组质粒pBI121-HN,并其通过电转化导入根癌农杆菌中,以根癌农杆菌为介导将HN基因导入苜蓿细胞。最终成功构建了重组表达质粒pBI121-HN,并通过根癌农杆菌转染苜蓿细胞将其在苜蓿中成功表达。本试验为家禽的植物性苜蓿疫苗的研究奠定了基础。

禽脑脊髓炎病毒VP1基因植物表达载体的构建

以提取的禽脑脊髓炎病毒总RNA为模板,以P1和P2为引物,反转录为cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增。将扩增产物克隆pMD18-T载体中,获得重组质粒pMD18-T-VP1,PstⅠ/BamHⅠ双酶切及PCR确认正确后,利用pMD18-T-VP1重组质粒为模板,以P3和P4为引物,经PCR扩增获得了大小约810bp的产物。VP1基因和pBI121植物表达载体用SmaⅠ和SacⅠ双酶切,经纯化后连接,再转化到EHA105农杆菌中,酶切和测序鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒pBI121-VP1,为进一步利用转基因植物生产VP1蛋白奠定了基础。

拟南芥PR-1基因启动子的克隆与植物表达载体的构建

根据已报道的拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)病程相关蛋白基因(PR-1)序列设计引物,通过PCR技术从拟南芥中扩增得到水杨酸诱导表达的PR-l基因启动子片段,序列分析表明,该启动子含910bp核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99.7%。将该启动子构建到植物表达载体pBI121上,获得病程相关蛋白基因(PR-1)启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体pBI-pr1p,将其转入根癌农杆菌GV3101,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,为深入研究寄主-病原物相互作用的分子机理奠定基础。