大蹼铃蟾皮肤分泌液中抗菌活性肽的分离纯化及其性质

通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５、Ｇ－５０和Ｇ－２５洗脱等步骤，从云南产大蹼铃蟾（Ｂｏｍｂｉｎａｍａｘｉｍａ）皮肤分泌液中分离得到了一种有广泛抗菌活性的多肽，被命名为ＭＳＰ－Ⅶ。用快原子轰击质谱（ｆ．ａ．ｂ．ｍ．ｓ）分析其Ｍ＋／Ｚ＝２６４８，即此活性肽的分子量为２６４７Ｄ。用自动氨基酸分析仪分析，含有２６个氨基酸。抗菌实验结果表明，此多肽对格兰氏阴性和格兰氏阳性细菌以及真菌都有较强的抗菌活性。溶血实验表明此活性肽有很轻微的溶血活性。此外，ＭＳＰ－Ⅶ也可以促进平滑肌收缩和增加微血管的渗透性。

东方铃蟾消化道5-羟色胺免疫活性细胞的免疫组织化学定位

应用5-HT抗血清,以ABC(avidin-biotin-peroxidase complex)免疫组织化学方法,对东方铃蟾(Bombinaorientalis)消化道内的5-HT免疫活性细胞(5-Hydroxytryptamine immunoreactive cell,5-HT cell)进行了免疫组织化学的定位研究和形态学观察,并探讨其分布型的成因及细胞形态与功能的关系。结果表明,5-HT细胞在东方铃蟾消化道的各个部位均有分布,其中以胃贲门部分布密度为最高:(55.73±10.67)个/mm2;胃幽门部次之:(42.99±5.25)个/mm2;直肠部最低:(6.37±4.78)个/mm2。5-HT细胞的形态多样:圆形、椭圆形、锥体形、长锥体形等,其中食管和直肠以圆形和椭圆形为主,小肠部则以长锥体形为主,其细长突起指向肠腔或固有膜。细胞分布于上皮基部、上皮细胞之间、腺泡上皮细胞之间或固有膜内;胃贲门部、胃体及胃幽门部5-HT细胞主要分布于腺泡上皮之间,也有的分布于胃上皮之间;肠部5-HT细胞主要分布于肠上皮之间。提示了东方铃蟾5-HT细胞分布型的形成与各部位消化功能及其食性和食物组成有关;5-HT细胞形态与其内、外、旁分泌功能是相适应的。

大蹼铃蟾抗菌肽-2对膀胱癌细胞株HLA-ABC以及DR表达影响的对照实验研究

目的 探讨大蹼铃蟾抗菌肽 2 (Maximin 2 )对膀胱癌细胞株HLA DR及HLA ABC表达的影响 ,并与TNF α、IFN α进行比较。方法 采用肿瘤细胞培养方法 ,流式细胞仪检测各实验样品对膀胱癌细胞株T2 4、BIU 87、SCaBER的HLA DR及HLA ABC表达的影响。结果 Maximin 2对不同的膀胱癌细胞株在小剂量下即有抑制作用 ,并呈剂量相关性 ,各实验样品未见对各膀胱癌细胞株的HLA DR表达有影响 ,Maximin 2、TNF α对HLA ABC的表达均无影响 ;IFN α则对HLA ABC的表达有上调作用。结论 Maximin 2、TNF α抗癌机制与提高肿瘤细胞HLA DR、ABC的表达无关 ,IFN α可通过提高肿瘤细胞HLA

三种蛙类呼吸系统比较解剖及进化关系探讨

对昆明地区滇蛙Rana pleuraden和昭觉林蛙R·chaochiaoensis及大蹼铃蟾Bombina maxi ma的呼吸系统比较解剖,结果表明,3种蛙鼻孔的开合与颏下肌的收缩无关;大蹼铃蟾的内鼻孔较昭觉林蛙与滇蛙的更靠近口前端;昭觉林蛙和滇蛙的下颌下肌倾斜走向,大蹼铃蟾的呈水平走向;滇蛙和昭觉林蛙喉气管室较膨大而长,环状软骨后端有棘突,大蹼铃蟾喉气管室狭小而短,环状软骨后端无棘突;昭觉林蛙和滇蛙喉肌共5对,大蹼铃蟾喉肌仅有喉口开肌和前杓肌2对;昭觉林蛙和滇蛙肺囊表面沟回较大蹼铃蟾的小而密。

温度对东方铃蟾和中华大蟾蜍肌组织ATP酶活性的影响

研究了不同温度对东方铃蟾和中华大蟾蜍肌组织中肌球蛋白钙激活ATP酶活性的影响。结果表明 ,从 1 6℃上升到 3 2℃ ,两种动物两种肌组织ATP酶活性均逐渐升高 ,但东方铃蟾ATP酶活性变化比中华大蟾蜍敏感 ;从 3 2℃上升到 4 4℃ ,ATP酶活性均下降 ,但东方铃蟾ATP酶活性变化比中华大蟾蜍更敏感 ;ATP酶活性的最适温度在 3 2℃。ATP酶活性可能与这两种动物的入眠。

大蹼铃蟾蛋白提取物对膀胱癌细胞株的抑制作用及对端粒酶的影响

目的 探讨大蹼铃蟾蛋白提取物对膀胱癌细胞株的抑制作用及对端粒酶的影响。方法 采用肿瘤细胞培养方法 ,检测大蹼铃蟾蛋白提取物对膀胱癌细胞株T2 4、BIU 87、ScaBer的抑制作用 ;以TRAP PCR ELISA方法检测大蹼铃蟾蛋白提取物对膀胱癌细胞株端粒酶表达的影响。结果 大蹼铃蟾蛋白提取物表现出对膀胱癌细胞株有较强的抑制作用 ;对膀胱癌细胞株端粒酶表达则无影响。结论 大蹼铃蟾蛋白提取物对多个膀胱癌细胞株具有直接细胞杀伤作用 。

两栖类动物皮肤分泌物及其生物学适应意义——大蹼铃蟾皮肤分泌物蛋白质多肽组的启示

以大蹼铃蟾(Bombina maxima)为代表性物种,揭示了两栖类皮肤分泌物蛋白质多肽组丰富的分子和功能多样性。目前在大蹼铃蟾已发现的分子包括3类不同的抗菌肽、缓激肽、缓激肽增强肽和缓激肽拮抗肽、缓激肽基因相关肽、富含脯氨酸铃蟾肽及其基因相关肽、神经调节素U、Bv8肽、三叶型蛋白和蛋白酶抑制剂等。抗菌肽分子多样性及其形成机制、缓激肽及其基因相关肽功能和表达模式的多样性都较好地揭示了在多样的生态条件下,两栖类皮肤活性肽环境适应的分子基础及生物合成的调控机制。富含血红素辅基的白蛋白广泛分布在大蹼铃蟾皮肤外皮层细胞膜上和真皮海绵层内,表明它在皮肤的生理功能,如在呼吸、物质交换和渗透压调节中有重要作用。两栖类皮肤分泌物蛋白质多肽组,由于其分子结构的多样性、新颖性和哺乳类同系物的存在,在生物医学研究和天然药物开发中具有独特和不可替代的价值;同时,两栖类皮肤功能基因组具有多样性丰富、快速重组突变的特征,是探讨生物适应的基因基础、基因形成机制和进化特性等生物学基本问题的优秀模型。

昆嵛山东方铃蟾的生物学特性及保护

对分布于胶东昆嵛山脉的东方铃蟾的种群特征和繁殖生态进行了研究， 其年龄组可分为幼体组（１－３１ ％）、亚成体组（１３－１６％ ）、成体Ⅰ组（３１－５８％ ） 和成体Ⅱ组（５３－９５％ ）， 雌雄性比为１－１６∶１。根据发育程度成体卵巢中的卵可分为５ 种类型。通过详细的测量和分析， 表明繁殖期成体的机能形态学指标表现出与生殖状态相关的明显而复杂的变化。

大蹼铃蟾与昭觉林蛙的肌肉系统比较

本文从肌肉系统对大蹼铃蟾和昭觉林蛙进行了观察比较 ,结果表明这两种无尾两栖类的肌肉系统存在一定差异。大蹼铃蟾的肌肉结合紧密程度不如昭觉林蛙 ,且肌肉分节现象较昭觉林蛙显著。最后 ,以形态 -功能-适应三位一体的分析原理为依据 ,就 2个种存在的形态差异 ,从功能与适应的意义和生物进化的角度两个方面进行了分析和探讨。

镜泊湖产东方铃蟾的染色体组型分析

用肠上皮制片方法研究了镜泊湖产东方铃蟾的染色体组型,其二倍体染色体数为2n=24,包括6对大型染色体、1对中型染色体和5对小型染色体。全部染色体中,第4、6、8、10染色体为亚中部着丝点染色体,其余为中部着丝点染色体,这一结果与前人的结果不同。

大蹼铃蟾皮肤白蛋白的胰蛋白酶抑制活性研究

通过离子交换层析和凝胶过滤层析,在大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤中得到其白蛋白。该蛋白有强烈抑制胰蛋白酶水解小肽底物的活性,但对其它丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。它以1∶1摩尔比同胰蛋白酶形成稳定结合的复合物。经测定发现,该蛋白对温度、pH值及还原剂二硫苏糖醇的耐受性较强,三种因素对其胰蛋白酶抑制活性影响不大。说明大蹼铃蟾皮肤白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,可能在大蹼铃蟾防御天敌捕食的过程中发挥重要作用。

东方铃蟾消化道组织学的初步研究

采用组织学方法对东方铃蟾的消化道进行了研究。结果表明:肠分为十二指肠、空肠和大肠。消化道管壁由粘膜层、粘膜下层、肌层和浆膜层构成。食道、胃和肠均为单层柱状上皮。胃和十二指肠的粘膜皱褶最丰富。食道腺为复泡状腺,胃腺属于单管状腺,肠的各段无多细胞腺体,但空肠和大肠有丰富的杯状细胞。肌层均为平滑肌,内层环肌较厚,外侧纵肌较薄,其中大肠的外侧纵肌最发达。

中国铃蟾属的分类和系统发育

铃蟾属Bombina分布地跨欧亚二洲。近数十年来,国外学者对这类原始无尾类的分类和进化进行过不少研究,但亚洲产种类的种间亲缘关系仍不清楚,有些种在分类上尚存在疑问。本文以形态为基础,辅以核型资料,试图对中国铃蟾属的分类和进化问题进行探讨。研究结果发现:中国南部产3种（亚种）之间的亲缘关系较近,是一个祖先的后裔。其中强婚刺铃蟾B.fortinuptialis和微蹼铃蟾B.microdeladigitora之间形态差异为不明显,故建议强婚刺铃蟾作为微蹼铃蟾的一个亚种。东方铃蟾B.orientalis另一支系,其形态和核型与欧洲产两种相似, 文中还进一步讨论了铃蟾属的亚属划分是正确的。最后综合有关资料,探讨了铃蟾属的种间亲缘关系和该属的分类地位,并结合地史资料进行了铃蟾属物种分化的初步探讨。

东方铃蟾在黑龙江省的现状与保护

2002—2006年通过样方法、样线法及访问调查，对黑龙江省32个县（市、区）东方铃蟾（Bornbina orientalis）的分布范围、栖息环境、种群状况、食物组成以及人工养殖等方面进行了调查分析。结果表明，东方铃蟾在黑龙江省主要分布于东南山地的尚志、延寿、宾县、阿城、绥芬河、宁安、海林等地，栖息在山溪的石下、草丛或路边、半山坡上的小水坑、石头坑等处，产卵场的种群密度为2．8只／m^2；东方铃蟾的食物以膜翅目和双翅目昆虫为主，其出现频率分别为46．97％和39．75％，此外，半翅目、鞘翅目、鳞翅目、蜘蛛目、中腹足目的动物也占有一定比例，而蜻蜓目和直翅目所占比例较小；实验室条件下可以对东方铃蟾进行人工饲养，死亡率较低，成体能存活2年以上，食物以黄粉虫（Tenebrio molitor）和蚯蚓为主，并能抱对产卵。由于人类活动造成的栖息地片段化，环境污染造成的栖息地质量下降以及干旱的气候条件等因素，东方铃蟾的分布范围和种群数量均呈缩减的趋势，因此建议加强立法、宣传教育和管理的力度，减少环境污染和人为活动对东方铃蟾栖息地的破坏，同时积极开展人工养殖方面的研究，解决饲料、繁殖、成活率等关键养殖技术。在保护的基础上开展合理利用。

东方铃蟾乳酸脱氢酶多态性研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离东方铃蟾不同组织ＬＤＨ同工酶，显示出典型的５条带谱。心肌具有以Ｂ亚基为主的ＬＤＨ同工酶谱，骨骼肌以Ａ亚基为主的ＬＤＨ同工酶谱。用改进后的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法进行种群调查，结果表明Ａ位点和Ｂ位点都存在电泳上的变异，各存在二个等位基因。Ａ位点有三个基因型，其频率；ＡＡ＝５３．４７％．Ａａ＝３９．１１％．ａａ＝７．４３％；Ｂ位点只检出二个基因型，即ＢＢ为９９．５０％，Ｂｂ为０．５０％。

大蹼铃蟾皮肤白蛋白的分离纯化及抗体制备

通过离子交换层析和凝胶过滤层析,在大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤中得到其白蛋白(BmA-skin).该蛋白具有较强的胰蛋白酶抑制活性.用0.5mg/只BmA-skin作为免疫源免疫大白兔,经三次免疫后,抽取大白兔血液,分离血清,饱和硫酸氨沉淀,获得抗BmA-skin的多克隆抗体.经ELISA方法测定该抗体与大蹼铃蟾白蛋白发生免疫反应,抗体滴度为1:100000.

大蹼铃蟾的线粒体基因组D-loop区序列分析

脊椎动物的线粒体DNA(mtDNA)是一段长度约为15-22Kb的环形片段,具有相对的保守性。D-loop区是线粒体基因组中的非编码区域的一部分,具有控制和调节的功能。本文采用LA-PCR和生物信息学的方法,研究了大蹼铃蟾的线粒体基因组D-loop区序列,其D-loop区具有三个保守序列(CSB-1,CSB-2 and CSB-3),在5`和3`端还有独特的串联重复序列。通过分析总结其串联重复序列的特征和规律,有助于研究蛙科动物线粒体基因组进化机制。

北京地区人工引入东方铃蟾种群的遗传变异分析

北京地区现有东方铃蟾为1927年由山东烟台人工引进的200余只个体的后代,历经几十年独立进化,无新个体引入,成为研究动物种群独立进化的良好样本。实验基于线粒体及微卫星标记,对取自北京香山人工引进种群和山东烟台源种群栖息地的55只东方铃蟾样品进行了种群遗传变异分析。线粒体标记显示,北京及山东种群单倍型多样性分别为0.489和0.950,核苷酸多样性分别为0.0018和0.0033。系统进化树(NJ/ML)及单倍型间的网络图均显示两种群间的单倍型未形成显著的谱系分化。微卫星标记显示,北京及山东种群的观测杂合度分别为0.468和0.631,期望杂合度分别为0.548和0.701。Structure 软件将扩增成功的54只个体归为北京、山东两个遗传聚类簇。总体看来,北京种群显示出较低的遗传多样性,出现隔离进化衰退趋势,但仍处于适中水平,能够维持种群生存。因此,无需引入新个体。

大蹼铃蟾皮肤膜联蛋白Ⅱ相关蛋白的分离纯化及活性

通过阴离子交换、凝胶过滤和阳离子交换层析,从大蹼铃蟾皮肤中纯化到一个表观分子量为33kDa的单链蛋白。N-末端序列比较分析显示,该蛋白与来自非洲爪蟾、红色原鸡和人膜联蛋白Ⅱ的N-末端序列相同的氨基酸分别占70%、64%和56%。该蛋白具有以钙依赖的方式抑制专一性血小板膜糖蛋白Ⅵ受体激动剂———Stejnulxin诱导洗涤人血小板聚集的生物学功能,最大抑制率达48%。结合其N-末端序列BLAST搜索结果及其活性的钙依赖性,推测该蛋白是与膜联蛋白Ⅱ相关的一类蛋白质。

大蹼铃蟾冬眠前后肥满度分析及部分内脏器官的变化

于2008年10—11月和2009年3—4月,测定了昆明市东北郊大蹼铃蟾冬眠前后的整体肥满度、躯体肥满度、肝系数、脂肪体系数及生殖腺系数等生理指标,并进行差异显著性检验。结果表明:整体肥满度K和体质量/体长指标KWL在不同性别间变化有差异;按体长数理统计法,将雌雄个体均划分为成体1龄和成体2龄,比较1龄和2龄个体间的K和KWL,表明用KWL检验不同年龄间个体身体状况的差异更准确。冬眠后两性的肝系数均显著下降,脂肪体系数变化均不显著;生殖腺系数的变化和营养消耗均表现出性别差异;在雌雄个体中均不能明确在冬眠期间主要消耗的营养物质来源,推测其在此期间可能有短暂的捕食行为。