不同饲育方式对家蚕产卵量及卵黄蛋白相关基因表达的影响

为探究人工饲料与桑叶不同搭配饲育方式对家蚕产卵情况及卵黄蛋白相关基因表达的影响,本研究采用全龄桑叶育(Mul1-5)、1~2龄人工饲料育+3~5龄桑叶育(Art1-2)、1~3龄人工饲料育+4~5龄桑叶育(Art1-3)、1~4龄人工饲料育+5龄桑叶育(Art1-4)4种饲育方式饲养菁松×皓月,调查不同饲育方式下的造卵量、产卵量、百粒卵重及卵黄蛋白基因Vg、30Kc19、ESP、VgR的表达情况。结果表明,Mul1-5的24 h产卵量、造卵量及百粒卵重均最高,造卵数量和百粒卵重都随人工饲料饲喂龄期延长呈现下降趋势;Mul1-5和Art1-2的造卵量显著高于Art1-3和Art1-4,Mul1-5的百粒卵重显著高于其他3个组合。利用荧光定量PCR方法测定了4种饲育方式下卵黄蛋白相关基因的表达情况,结果显示,Vg从5龄第7天开始到整个蛹期结束持续表达,整体表现为Art1-3的表达量最高,Art1-2的次之,Art1-4的最低;30Kc19在5龄第7天及上蔟第1天表达量较高,并分别以Art1-2和Art1-3方式下最高,蛹期基本不表达;ESP和VgR在整个蛹期都有表达,但以第5~8天的表达量较高,且第5~7天以Art1-4的最高,第8天以Art1-3的最高。综合来看,人工饲料育替代桑叶育的龄期越长,家蚕产卵数量和百粒卵重下降越明显,卵黄蛋白相关基因的表达受影响越大,这可能与人工饲料的配方、家蚕对人工饲料的吸收利用程度及人工饲料育后家蚕的体质有关,具体影响机制还需进一步研究。

家蚕蚕卵孵化率影响因素的研究进展

昆虫是自然界最为丰富的生物类群,其中大多数为农林业害虫,但也有少数为人类服务的经济昆虫,如作为鳞翅目模式生物的家蚕,数千年来一直是丝织品原料的主要来源。孵化是卵生昆虫后续生命活动的基础,了解影响家蚕孵化的因素,有利于提高家蚕孵化率,增加蚕茧产量和经济效益。本文介绍了影响家蚕蚕卵孵化率的温度、湿度、光照等环境条件及家蚕发育过程中基因调控的研究进展。

一种家蚕微孢子虫感染成品卵检测方法的研究

感染家蚕微孢子虫的成品卵检测是业内关注的技术问题之一。用磨碎管分装1000粒蚕卵并加海绵塞,进行一段式催青的实验室二日孵化率达98.25%或以上,对生产用不同蚕品种、越年或冷藏浸酸蚕种及不同单位生产蚕种的二日孵化率最低为94.40%。用含0.01%十二烷基磺酸钠和2.00%氢氧化钠的溶液浸泡和磨碎蚕卵样本(约1000粒),固形物去除率为83.38%。5龄起蚕添食感染5×10^(5)颗/mL家蚕微孢子虫孢子悬浮液后获取的混合蚕卵,在催青孵化后第7天检出率明显上升。1000粒蚕卵混入3000颗家蚕微孢子虫孢子的检出率为100%。蚕卵磨碎液用PBS缓冲液(pH=7.2~7.6)稀释40倍或以上时,qPCR法检测可稳定检出家蚕微孢子虫,检测灵敏度为4×10^(6)颗/mL,低于光学显微镜法的1.5×10^(3)颗/mL。105个一代杂交蚕种母蛾检疫批(166623张毛种)母蛾检测和蚕卵集团检测的检出情况类似。不论是母蛾检测还是成品卵检测都涉及家蚕微孢子虫的胚传率和流行病学风险管控的阈值确定,上述研究提供了一种成品卵集团检测的方法,但实际应用尚需更为丰富的流行病学调查数据。

家蚕品种“湘晖”转青卵的冷藏抑制试验及数据统计分析

家蚕转青卵冷藏抑制胚胎发育在生产上具有实用价值。为了探讨转青卵适宜的冷藏抑制处理时间,以家蚕品种“湘晖”为材料开展试验。试验于2022年、2023年分2个批次完成,设置5个不同冷藏抑制天数的试验组及对照组(不抑制),蚕卵孵化后调查一日孵化率,并对一日孵化率进行平方根反正弦转换得到的新转换值做方差分析。结果表明,对照组蚕卵的一日孵化率最高,而5个冷藏抑制组随着冷藏抑制时间的增加,一日孵化率呈逐渐下降趋势;2个批次的一日孵化率转换值均值有极显著差异(α=0.05,P<0.01);进一步做两两比较,2022年(第1批次)的一日孵化率转换值对照组与4个抑制组(冷藏抑制2~8 d)间无显著差异(P>0.05),而2023年(第2批次)的对照组与5个抑制组间的差异极显著(P<0.01),具有统计学意义。以上结果提示,“湘晖”2个批次试验蚕卵不同冷藏抑制时间处理组的一日孵化率均值不全对应相同,推测可能还存在其他因素与冷藏抑制因素一起共同影响了“湘晖”转青卵的一日孵化率。从生产效益考虑,建议家蚕品种“湘晖”非必要则不将转青卵做冷藏抑制处理,如若一定要进行转青卵的冷藏抑制,处理时间应控制在1周内为宜。

家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究

根据家蚕微孢子虫rRNA基因高度保守的特点,设计合成了1对PCR引物,从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增出1个12kb片段,用同位素标记后作为检测家蚕微孢子虫的特异性探针。采用原位杂交的方法,对家蚕卵及感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫进行原位杂交检测。实验结果表明,该方法可以从家蚕单粒卵内检测到296粒孢子,对感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫均有阳性杂交信号出现。

盐酸处理蚕卵酯酶A4的活性变化及其与滞育性的关系

从家蚕C108品种蚕卵精制酯酶A4，首次测定了产卵后24～96h浸酸蚕卵酯酶A4的ATPase活性。蚕卵经盐酸处理后在体外5℃1～2d或体外25℃1～3h出现酶活性峰。与低温活化蚕卵比较，产卵后24～96h的浸酸蚕卵，在体外5℃酶活性峰出现时间提早了8．5～22d，在体外25℃提早了3～9h。浸酸后蚕卵迅速解除滞育，滞育发育时间显著缩短。将不同卵龄未浸酸蚕卵与盐酸处理蚕卵酯酶A4的ATPase活性峰出现时间差制成曲线，在体外5℃或25℃的结果几乎都完全与5℃冷藏时蚕卵的滞育发育时间曲线重叠。盐酸处理蚕卵酯酶A4的活性变化与蚕卵活化有高度相关性。

家蚕卵突变体“明”死卵(l-e^m)的卵壳构造和遗传分析

在家蚕品种"明"中发现一种卵突变体,其卵产下后10 min左右即出现失水凹陷,1 h左右完全失水,全部溃死。解剖观察母蛾卵巢管,卵在其内排列整齐,大小和色泽都与正常卵无异;电镜观察死卵,精孔、后极部与正常卵无差异,但卵壳表面凹陷处网格皲裂,其切面的中层可见有裂纹。遗传分析表明:该家蚕卵突变体由一个隐性遗传基因控制,纯合致死,遵循伪母性遗传模式。该突变体是一个不同于溃卵(Grcol)突变体的卵壳新突变,暂命名为"明"死卵(lethal egg of"ming",l-em)。

家蚕卵黄原蛋白及其受体基因

家蚕小卵突变体 (Smalleggmutant ,sm) ,其卵体积仅及正常卵的 2 / 3,不能受精而致死。因其卵母细胞不能正常吸收卵黄原蛋白 (Vg) ,人们认为其原因可能是卵黄原蛋白受体基因 (VgR)突变所致。本研究首先通过克隆筛选和基因组序列分析 ,获得了 2 5 6 4bp含有 ployA的家蚕卵黄原蛋白受体基因 (BmVgR)片段。将该基因片段的预测蛋白与其它物种的VgR/YPR和低密度脂蛋白受体 (LDLR)家族比较 ,发现该基因具有LDLR家族的基本结构特征。其次 ,经RT PCR检测 ,结果表明BmVgR在sm的不同时期的卵母细胞中都能正常转录。最后 ,分别对sm不同发育时期的体液和卵的总蛋白进行SDS PAGE分析 ,发现该突变体的卵母细胞不能正常摄取体液蛋白 (包括Vg)。综合分析 ,sm不能正常摄取Vg ,可能并不是VgR的功能异常导致 。

冷藏期家蚕滞育卵和即时浸酸卵的H_2O_2含量及过氧化氢酶基因表达的变化

将产下后48h的家蚕滞育卵和即时浸酸卵进行低温(5℃)冷藏处理30d以上,滞育卵孵化率显著上升,而即时浸酸卵孵化率显著下降。为了探讨低温处理对滞育卵和即时浸酸卵的孵化产生不同影响的分子机制,测定了冷藏期间2种卵中的H2O2含量、过氧化氢酶(CAT)基因mRNA转录水平和CAT活性变化。结果表明:2种卵在冷藏期间随着卵中的H2O2含量显著增加,CAT基因mRNA转录水平也上调;虽然冷藏后的10～70d,2种卵中的H2O2含量、CAT基因mRNA转录水平及CAT活性都显著上升,但滞育卵的H2O2含量仍显著高于即时浸酸卵,而CAT基因mRNA转录水平和CAT活性则显著低于即时浸酸卵。即时浸酸卵在冷藏过程中H2O2含量显著增加,可能造成了对胚胎的氧化伤害,从而降低其孵化率。然而,滞育卵在冷藏过程中的CAT基因mRNA转录水平及CAT活性相对较低,H2O2相对较高,胚胎却未受到氧化伤害,推测低温处理可能诱导了滞育卵中其它抗氧化反应。

体外盐酸处理与PIN对酯酶A4活性影响的关系

从家蚕Ｃ１０８ 品种产下后２ｄ 的滞育性卵纯化酯酶Ａ４ 及其活性抑制多肽ＰＩＮ，体外调查了盐酸处理与ＰＩＮ 对酯酶Ａ４ 的ＡＴＰａｓｅ 活性影响的关系。结果表明：盐酸处理不仅迅速消除了ＰＩＮ 对酯酶Ａ４ 的ＡＴＰａｓｅ 活性抑制作用；盐酸处理使蚕卵酯酶Ａ４ 的ＡＴＰａｓｅ 活性峰提早出现的时间还反映了蚕卵的滞育发育时间。

低温处理对家蚕滞育卵还原型与氧化型谷胱甘肽比值的影响

还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的比值反映出细胞的氧化胁迫状况。利用分光光度法分别测定家蚕滞育卵持续25℃保护和经5℃低温处理后卵内谷胱甘肽代谢的变化,探讨蚕卵的谷胱甘肽代谢与滞育解除的关系。与持续25℃滞育温度条件下的蚕卵相比,5℃低温解除滞育的处理显著提高了蚕卵总谷胱甘肽含量、GSSG含量和硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)活性,而显著降低了GSH含量以及GSH/GSSG比值。结果表明,低温处理过程中,滞育卵TPX活性显著升高,间接地促进GSH氧化为GSSG,使GSH/GSSG比值显著下降,由此导致蚕卵处于过氧化状态。

盐酸刺激量对家蚕卵酯酶A4活性的影响及其与蚕卵活化的关系

将产卵后 2 4～ 96h( 2 5℃ )的蚕卵 ,用相同或最佳盐酸刺激量 (浸酸后点青最快、点青卵率最高 )浸酸处理 ,卵龄越大 ,蚕卵点青越迟。蚕卵的点青时间在一定范围内随盐酸刺激量增大而提前 ,超过这一范围 ,则随刺激量增大而延迟。卵龄增大 ,蚕卵酯酶A4和ATPase特征性活性峰出现时间延迟 ;蚕卵经盐酸处理 ,该时间明显提前。产卵后 96h盐酸处理蚕卵 ,酯酶A4的活性峰出现时间随盐酸刺激量增大而提前。随着浸酸卵龄和盐酸刺激量的改变 ,蚕卵酯酶A4的活性峰出现时间与蚕卵点青时间发生一致的变化。盐酸刺激量能够影响蚕卵的活化 (或滞育发育期 )和发育速度。

家蚕滞育生物钟蛋白质Ease A4的纯化及其分子结构分析

ＥａｓｅＡ４是家蚕卵的一种滞育生物钟蛋白质．产下后２ｄ的家蚕Ｃ１０８品种滞育性卵，经过丙酮脱脂、８５℃热处理、硫酸铵沉淀和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５凝胶过滤层析初步分离，进一步经过Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８脱盐浓缩，ＨＰＬＣ（柱为ＹＭＣ－ＰａｃｋＰｒｏｔｅｉｎ－ＲＰ）分离，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＭＡＬＤＩＭＳ方法鉴定，纯化得到ＥａｓｅＡ４蛋白质．从１０ｇ蚕卵最终得到了１１．８μｇＥａｓｅＡ４．ＥａｓｅＡ４由从Ｈｉｓ到Ｔｙｒ的１５５个氨基酸残基构成，蛋白质部分的分子量为１６６０１．其２２位氨基酸残基Ａｓｎ处有一个Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ糖基化场所，并有糖基结合在该部位，糖基的分子量约为７６０．ＥａｓｅＡ４的６１位和１５０位的两个Ｃｙｓ氨基酸残基之间存在二硫键．糖基和二硫键的存在不仅有利于酶蛋白的分离。

家蚕滞育卵浸酸后易溶性蛋白的表达差异分析

探明浸酸解除家蚕卵滞育的关联蛋白,可为改进和提高蚕种的人工孵化技术提供理论依据。以经2.5℃冷藏45 d的家蚕品种"7.湘×9.芙"滞育卵为材料,采用双向凝胶电泳和图像分析技术,比较浸酸与未浸酸蚕卵易溶性蛋白的差异变化。在未浸酸蚕卵的双向电泳图谱中共检测到523个蛋白质斑点,其中特异性蛋白质斑点41个;浸酸卵共检测到526个蛋白质斑点,其中特异性蛋白质斑点44个。浸酸与未浸酸蚕卵能相互匹配的蛋白质斑点有482对,匹配率91.897%。经对比分析,浸酸活化后的蚕卵蛋白出现了一些特异性的蛋白质斑点,或某些蛋白质斑点在含量上出现了差异变化。

家蚕多肽抑制因子对酯酶A4的ATP酶活性影响

从产下后２ｄ的家蚕Ｃ１０８品种滞育性卵精制酯酶Ａ４和其多肽抑制因子ＰＩＮ，体外调查了ＰＩＮ对酯酶Ａ４的ＡＴＰ酶活性影响。酯酶Ａ４和ＰＩＮ５℃混合２５～１３ｄ，除去ＰＩＮ后５℃保护，ＡＴＰ酶活性峰都在１２～１４ｄ后出现；２５℃混合时，除去ＰＩＮ后，ＡＴＰ酶活性峰出现时间为混合时间再加１２～１４ｄ。利用ＭＡＬＤＩＭＳ方法，首次检测到纯化的酯酶Ａ４和合成ＰＩＮ的结合体。

家蚕突变矮小卵血液蛋白及卵黄蛋白的研究

对家蚕突变矮小卵 (emi)品种在卵母细胞形成时期的血液、卵巢及卵中的总蛋白进行SDS PAGE发现 :在emi的卵巢及卵中含有卵黄蛋白 (Vn)、卵特异性蛋白 (ESP)和大部分的低分子量脂蛋白 (LP) ;emi蚕在蛹期和蛾期的血液中有卵黄原蛋白 (Vg)和LP ,蛹后期大部分emi血液中的Vg和LP含量逐渐减少 ,化蛾时血液中仅含少量的Vg和LP ,而少数emi个体的卵母细胞大量退化 ,在蛹后期和蛾期血液中还含有大量的LP和较多的Vg ;emi蚕从吐丝当天到蛾期的血液中的LP中有分子量为 30kD的蛋白带 ,在卵中却没有。以上结果表明 ,emi基因可能不仅决定卵大小 ,还可能对LP的不同成分的吸收 (如不能吸收LP中分子量为 30kD的蛋白 )有关 。

家蚕滞育卵长期保存的研究

调查了不同温度保存的９个原种及２对杂交种的滞育性及多元醇量的变化，对长期保存卵进行了养蚕试验。结果表明：５℃保存卵在产卵１００日后滞育开始解除，１５０日左右孵化率达到最高峰，２００日后急剧下降。不同品种间无明显差异。１℃保存卵在产卵后１８０日左右开始解除滞育，原种在２００－３００日之间孵化率最高，３００日后显著降低，而杂交种产卵后４５０日孵化率仍在８０％以上。－１．５℃保存卵在产卵后５００日仍呈滞育状态，但转入５℃保存８０日后可获得孵化能力，到产卵后７００日孵化率大致在６０％左右。不同温度保存卵滞育的解除，与卵内山梨醇及甘油量的减少呈相同趋势。养蚕结果表明，用１℃保存４１０日以及－１．５℃保存７００日的杂交种，除孵化率比当年生产的冷藏浸酸种低外，其它饲育成绩无明显差异。

即时浸酸显著提高滞育性家蚕卵辅酶Ⅰ和Ⅱ含量

即时浸酸在阻止家蚕Bombyx mori卵滞育发动的同时,提高了其呼吸耗氧量,抑制了山梨醇积累。本研究利用HPLC法测定了家蚕滞育卵和5min即时浸酸滞育性卵中辅酶Ⅰ和Ⅱ含量。结果表明:产下后24-72h,家蚕滞育卵中NAD,NADH,NADP和NADPH含量分别下降了30%,37%,50%和4%;而即时浸酸滞育性卵中分别增加了77%,46%,142%和241%。不过,即时浸酸并未显著改变滞育性家蚕卵中NADH/NAD和NADPH/NADP比值。据此推测,即时浸酸提高滞育性家蚕卵辅酶Ⅰ含量与其呼吸耗氧量增加有关;即时浸酸显著提高辅酶Ⅱ含量与山梨醇积累抑制无关,而主要与生物合成加强有关。

家蚕滞育卵与非滞育卵中几种关键酶活性的比较

家蚕Bombyxmori是卵滞育的昆虫,在滞育期间无形态变化,也不存在器官发育和组织分化,然而其生理代谢过程仍在进行。为进一步研究家蚕滞育的机制,本研究测定了家蚕滞育卵、即时浸酸处理的滞育卵及非滞育卵在胚胎发育过程中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,EC1.15.1.1)、过氧化氢酶(catalase,CAT,EC1.11.1.6)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK,EC2.7.1.40)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase,AchE,EC3.1.1.7)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH,EC1.1.1.28)的活性变化。结果表明:处理后1-7d,即时浸酸处理的滞育卵,SOD活性由56517.00U/g提高到81986.94U/g,CAT活性由14.98U/g提高到106.90U/g,PK活性由25.19U/g提高到181.70U/g,AChE活性由17.88U/g提高到287.86U/g,而LDH活性由169.96U/g下降到122.82U/g。而在非滞育卵中,SOD活性由86417.99U/g下降到66024.19U/g,LDH活性由169.07U/g下降到135.02U/g;CAT活性由1.47U/g提高到44.37U/g,PK活性由20.56U/g提高到92.09U/g,AChE活性由21.40U/g提高到99.17U/g。在滞育卵中,SOD和AChE活性较稳定;CAT活性随发育上升,而LDH活性随发育而下降;PK活性在胚胎发育的前4d呈上升趋势,随后基本保持稳定。通过了解家蚕滞育卵、非滞育卵与即时浸酸卵的相关酶活性在胚胎发育过程中存在的变化,有助于进一步揭示家蚕滞育的机理。