家蚕glial cell missing(BmGcm)基因鉴定、表达、亚细胞定位和功能

【目的】鉴定、克隆家蚕(Bombyx mori)glial cell missing(Bm Gcm)基因,分析其m RNA表达及亚细胞定位特征。制备多克隆抗体,同时在细胞水平进行过表达,检测Gcm对细胞增殖和周期的影响,为探究Bm Gcm功能打下基础。【方法】利用RACE方法克隆获得Bm Gcm全长c DNA序列,利用ORF Finder和SMART等在线工具对Bm Gcm基本序列特征和结构信息进行分析,运用Clustalx和MEGA 6.0等软件对多物种Gcm蛋白进行同源序列比对和进化分析。采用RT-PCR和q RT-PCR方法检测Bm Gcm的表达情况。利用原核表达系统获得重组蛋白,通过蛋白纯化和免疫小鼠制备多克隆抗体,运用Western blot对抗体进行检测。构建Bm Gcm表达载体,转染家蚕胚胎细胞系,分析其亚细胞定位情况,同时利用EDU细胞增殖标记和流式细胞仪对其功能进行探索。【结果】Bm Gcm(BGIBMGA006182)定位于4号染色体的nscaf2847上,其基因全长4 046 bp,包含4个外显子和3个内含子。其c DNA全长1 734 bp,包含166 bp的5′UTR、227 bp的3′UTR和1 341 bp的完整开放阅读框(ORF)。该基因编码446个氨基酸残基,预测蛋白分子量为50.61 k D,等电点5.557,含有典型的GCM结构域。多重比对结果显示GCM结构域在不同物种间具有高度的保守性,进化分析显示昆虫Gcm蛋白单独聚为一支,其中Bm Gcm蛋白与帝王蝶同源蛋白亲缘关系最为接近。表达分析结果显示Bm Gcm在胚胎发育第4天表达达到峰值,随后表达水平逐渐下调,而在幼虫阶段,Bm Gcm主要表达于中肠、精巢和卵巢。将Bm Gcm完整的开放阅读框序列构建至原核表达系统,经IPTG诱导和亲和层析纯化获得高纯度重组蛋白,通过免疫小鼠获得了多克隆抗体,Western blot检测该抗体可以特异性识别重组蛋白。在家蚕细胞系中过表达Bm Gcm蛋白,结果显示其定位于细胞核。在细胞水平,过表达Bm Gcm会明显抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞于G1/S期。【结论】克隆鉴定得到Bmgcm全长序列,获得其表达和亚细胞定位信息。通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠制备了可用的多克隆抗体。细胞实验发现Bm Gcm可以显著抑制增殖和影响正常的细胞周期进程。

星形胶质细胞与神经元在蚕丝素纳米纤维上的联合培养

目的：研究胶质细胞结合丝素纳米纤维对神经元生长发育的作用，为神经干细胞结合丝素蛋白材料用于临床移植修复神经系统损伤提供实验依据。方法：从新生大鼠脑室下区分离细胞与取自混合培养得来的星形胶质细胞共培养在柞蚕、家蚕2种丝素蛋白溶液制成的材料上，分别选取各时间段的细胞进行β-Ⅲ-tubulin特异性免疫荧光显色，并统计不同时间段神经元在丝素材料上的复杂度。结果：神经元与星形胶质细胞共培养在柞蚕丝素无纺布上（TSF）的复杂度明显比家蚕丝素无纺布（SF）高。结论：柞蚕、家蚕丝素无纺布结合星形胶质细胞支持神经元的生长，具有良好的生物相容性；胶质细胞结合柞蚕丝素无纺布比家蚕丝素无纺布更适合神经元的生长发育。

人GDNF在甲醇酵母及家蚕幼虫中的表达

将人胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)基因克隆入酵母分泌型表达载体 pPIC9K中 ,酶切线性化后电穿孔导入酵母细胞进行整合 ,经G418筛选得到多拷贝转化子 ,甲醇诱导表达。将人GDNF基因克隆入昆虫病毒转移载体 pBacPAK8中 ,与线性化Bm BacPAK6修饰病毒基因组DNA共转染家蚕细胞 ,经体内重组 ,筛选到重组病毒。用重组病毒感染家蚕幼虫 ,5d后收集血淋巴。SDS PAGE和蛋白质印迹杂交结果证实了酵母培养上清液及家蚕幼虫血淋巴中含有GDNF蛋白。活性研究表明 ,甲醇酵母及家蚕幼虫表达的GDNF蛋白能促进多巴胺能神经元的存活和突起生长。