Molecular cloning, expression and characterization of a novel geneβ-N-acetylglucosaminidase from Bombyxmori

Previously, we have reported that a gene encoding Bombyxmoriβ-N-acetylglucosaminidase 2 (BmGlcNAcase2) has been identified differentially expressed in the midgut of Bombyxmori strain NB resistant to nucleopolyhedrovirus (BmNPV), strain 306 susceptible to NPV and a near isogenic line BC9 with similar genetic background to 306 but resistant to NPV by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). To get more knowledge about the relationship between β-N-acetylglucosaminidase and the resistance of NPV, in this study, the 1542 bp open reading frame of a putative bombyxmoriβ-N-acetylglucosaminidase 2 gene (BmGlcNAcase2) was amplified from a pool of bombyxmoricDNAs and inserted into the prokaryotic expression plasmid pET-30a(+).Western blotting analysis showed that BmGlcNAcase2 was expressed in hemolymph, ovary, testis, fat body, trachea, midgut and silk gland of fifth instar larvae respectively . Immunofluoresence analysis indicated that BmGlcNAcase2 was mainly located to the cytoplasm or some structure in cytoplasm.

14种农药对9·芙家蚕(Bombyxmori)的急性毒性评价

旨在为桑园及周围农田合理用药提供科学依据,采用浸叶法首先比较了乐果对8种广东地区常见家蚕品系的急性毒性,并筛选出对乐果最敏感品系为9·芙,可推荐作为农药登记和风险性评估的广东地区的家蚕品种。同时对浸叶法中2种常见晾干方式进行了比较,以完善并提高家蚕急性毒性试验浸叶法的可比性和可靠性。结果表明,平铺自然晾干法更接近自然环境中桑叶接触农药后干燥的状态。以9·芙家蚕为供试蚕种,评估了14种农药对家蚕的急性毒性,结果表明:甲氧虫酰肼、阿维菌素和氯虫苯甲酰胺对家蚕96h的LC_(50)值分别为O.144、0.015 5和0.025 5mg a.i./L,属于剧毒级;噻虫嗪、杀螟丹、茚虫威对家蚕96h的LC_(50)值分别为1.94、3.87和2.76mg a.i./L,属于高毒级;杀菌剂吡唑醚菌酯对家蚕96h的LC_(50)值为20.8mg a.i./L,属于中毒级;杀虫剂虫螨腈、乐果,杀菌剂咯菌腈、戊唑醇以及除草剂双草醚、烟嘧磺隆和炔草酯96h的LC_(50)值均>200mg a.i./L,属于低毒级。因此,在桑园及其附近大田使用农药时,应采取适当措施降低其对家蚕的急性毒性,同时严格控制安全间隔期,以免对桑蚕生产造成损失。

家蚕表皮蛋白基因的生物信息学分析

家蚕的表皮蛋白(cuticular protein)是家蚕重要的结构蛋白,与几丁质一同作为家蚕表皮的重要组成部分。运用生物信息学的方法对家蚕表皮蛋白进行了广泛分析。通过保守的基序检索家蚕基因组,得到163条候选的表皮蛋白序列,包括RR、Tweedle、CPF&CPFL等家族,并且发现具有确定的保守基序的表皮蛋白基因在染色体上都是以串联集群形式分布。氨基酸组成分析表明,这些表皮蛋白富含甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、组氨酸等。运用Sig-nalP server预测这部分蛋白质有85%都具有信号肽。进化分析显示,负选择是家蚕表皮蛋白基因进化的主要驱动力。采用TFSEARCH等在线服务软件分析发现,在70%含有RR基序的家蚕表皮蛋白基因的核心启动子区具有通用的TATAAA序列。

紫外线诱导家蚕胚胎细胞BmE-SWU1的凋亡研究

UVB诱导家蚕胚胎细胞BmE-SWU1不同时间后,用四氮唑盐法(MTT)和Hoechst染色及DNA-Ladder法分别检查BmE-SWU1细胞的增殖活性和凋亡情况.该实验研究了紫外线诱导对家蚕胚胎细胞BmE-SWU1凋亡的影响,建立了紫外线诱导家蚕细胞凋亡的简单模型,为家蚕变态发育过程中细胞凋亡的研究奠定了基础.结果表明:UVB处理家蚕BmE-SWU1细胞后,细胞增殖活性随着照射剂量的增加而逐渐降低;光学显微镜下可见细胞膜表面突出或出现小泡,经Hoechst染色后,凋亡小体在荧光显微镜下清晰可见,细胞DNA电泳条带呈梯形分布,这是凋亡细胞典型的生化特征.

家蚕品种P50和C108后部丝腺的表达序列标签及单核苷多态性比较

利用BLAST软件对家蚕品种P50和C108的4眠及5龄幼虫后部丝腺的表达序列标签(EST)进行比较,从分子水平证明了5龄期后部丝腺蛋白合成比4眠期更加活跃。运用S im4和D iffseq工具就EST比对结果进一步分析,在两个家蚕品种中共发现有1 584个单核苷酸多态(SNP),其中颠换型变异的SNP达820次,占51.77%,转换型变异的SNP达764次,占48.23%;发现有2 776个插入/缺失(InDel)变异,其中1 bp的InDel占了48.56%,小于27 bp的InDel达到了90%以上。研究结果从基因组水平上阐明了这两个家蚕品种间的多样性。

传染性软化病病毒感染家蚕中肠上皮细胞的免疫电镜观察

家蚕传染性软化病病毒(Bombyxmoriinfectious flacherie virus,BmIFV)专一地侵染家蚕中肠上皮组织,造成中肠上皮细胞的超微结构发生病变,在染毒家蚕的中肠杯形细胞内形成特异性小泡体和电子稠密体等特异性结构。电镜观察显示,在感染早期,微绒毛膜、线粒体附近及相邻两个细胞的细胞膜和内质网中较易发现胶体金颗粒(10 nm)的吸附;其后在微绒毛中间和细胞质中,以及内质网和特异性小泡体的界限膜附近出现或较多存在,但线粒体和特异性小泡体的内部未见金颗粒的吸附。因此可以认为:家蚕传染性软化病病毒主要在染毒细胞的各细胞器膜附近出现。

4种农药对家蚕的毒性评价和中毒症状观察

采用食下毒叶法,测定了4种农药对家蚕的毒性,观察了4种农药处理2龄家蚕后的中毒症状。结果表明,3种杀虫剂除虫菊素5%乳油、吡虫啉2.5%可湿性粉剂和氯胺磷20%乳油的LC50值均在0.1～10mg/L之间,对家蚕属高毒级,有极高风险性;杀菌剂苯醚.丙环唑300g/L乳油的LC50值为5.60×102mg/L,对家蚕属低毒级,风险性相对较低。观察了中毒症状,3种杀虫剂引起家蚕中毒症状较突出,易于辨别,杀菌剂引起的家蚕中毒症状较轻微。桑园及附近用药时需特别注意避免喷施3种杀虫剂。

家蚕氨酰-tRNA合成酶基因分析

为了探讨家蚕氨酰-tRNA合成酶(BmaaRS)基因的数目、种类、结构及起源,利用家蚕基因组数据和EST数据进行了BmaaRS基因的电子克隆,结果表明,家蚕核基因组中含有2套不同的aaRS核基因,分别编码线粒体和细胞质BmaaRS,但编码线粒体BmSerRS的基因有2个,可能缺少编码细胞质的BmHisRS基因和编码线粒体的BmGlnRS、BmLysRS、BmGlyRS和BmThrRS基因,这些基因的功能可能由具有相似功能的其他蛋白完成,或通过某个BmaaRS基因的可变剪接分别形成不同功能的BmaaRS。EST证据表明,BmaaRS基因存在不同形式的可变剪接;BmaaRS氨基酸序列的相似性及二、三级结构分析表明部分BmaaRS存在结构域的扩增,有些不同的BmaaRS具有相同结构域,相同功能的BmaaRS具有相似的三级结构;进化分析表明,BmaaRS为2套不同来源的BmaaRS基因编码,细胞质和线粒体BmaaRS的起源不同。

人工饲料育家蚕/杆状病毒表达猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因

以重组病毒Bm-BacPAK6-E2接种全龄人工饲料育及5龄桑叶育家蚕皓月×菁松幼虫、蛹,观察重组病毒的感染发病情况,调查病蚕、蛹的采血量并进行SDS-PAGE分析.结果表明,全龄人工饲料育家蚕接种重组病毒的成功率、采血量等指标均与5龄桑叶育相近,SDS-PAGE蛋白质电泳在家蚕幼虫、蛹血淋巴中均检测到1条与目的蛋白理论分子量(63 kD)相符的特异性蛋白条带,初步认为是重组病毒Bm-BacPAK6-E2的融合表达产物.

不同剂型的毒死蜱对家蚕的急性毒性评价

为明确毒死蜱对家蚕的安全性,采用浸叶法测定了4种不同剂型的毒死蜱对家蚕的毒性及其对家蚕中毒症状的观察统计。结果表明:45%毒死蜱乳油、15%毒死蜱颗粒剂、25%毒死蜱微乳剂和36%毒死蜱微囊悬浮剂对2龄家蚕96 h的LC_(50)值分别是0.176 mg/L、0.452 mg/L、1.76 mg/L和2.84 mg/L;45%毒死蜱乳油和15%毒死蜱颗粒剂为剧毒,25%毒死蜱微乳剂和36%毒死蜱微囊悬浮剂为高毒,其中微囊悬浮剂对家蚕的毒性最小。经药剂处理后,家蚕的中毒症状主要有吐液、侧卧以及体色发黑。虽然4种不同剂型中毒死蜱微囊悬浮剂毒性最小,但其仍属于高毒,因此,建议毒死蜱远离桑园及桑园附近农田使用,尤其是家蚕饲养盛期。

SARS-CoV S蛋白在大肠杆菌和家蚕中的表达

将SARS-CoV S蛋白基因的部分序列(accession number为AY304495的22 908-23 542 nt区域),克隆到表达载体pET28 a(+)中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,重组S蛋白的分子量约为27 kD,与理论分子量相符。将S蛋白基因的部分序列克隆入杆状病毒转移载体pBacPAK-H is后,与线性化家蚕杆状病毒BmBacPAK-6共转染BmN细胞,经空斑筛选获得重组杆状病毒BmBac-S,并将其在细胞和家蚕中进行表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,表达产物的分子量约30 kD,用金属螯合亲和层析纯化得到家蚕细胞表达的重组S蛋白。

家蚕微粒子(Nosema bombycis)种群数量动态的研究

用家蚕微粒子(Nosemabombycis)对家蚕进行攻毒,诱发微粒子病发生,对染病蚕肠液、血液、体内微粒子种群数量动态分别进行了研究,结果表明:肠液内微粒子种群变化呈锯齿形上升变化,其增长规律可用一元线性回归方程表示;血液中微粒子种群随时间函数动态变化的数学模式可用3次方程来拟合;蚕体内微粒子种群则按指数增长方式随时间函数动态变化,属J型数学增长模式.从3个系统层次,3种不同的增长规律,揭示了3种完全不同的增殖机制.

四川省现行主推家蚕品种资源对BmNPV的抗性研究

BmNPV（核型多角体）病毒病是养蚕生产上最常见、危害最严重的一类蚕病,选育对BmNPV高抗力的家蚕品种是家蚕品种选育的主要攻关课题之一。为了摸清四川现行蚕品种资源对BmNPV的抗性以及和国内高抗BmNPV蚕品种的差异,本文通过人工经口添食BmNPV病毒的方法对川山、蜀水等20多个四川省主要家蚕品种的抗BmNPV性能进行了检测,旨在掌握不同品种对BmNPV抗性差异,筛选对BmNPV高抗性的育种素材,为选育BmNPV高抗病品种奠定基础。试验结果显示：不同品种对BmNPV抗性存在显著差异,其中871C、872C对BmNPV的半数致死浓度（LC_（50））均达10~9p/mL以上,对BmNPV的抗性显著。其它品种对BmNPV的半数致死浓度（LC_（50））分布在10~4~10~5p/mL范围内,对BmNPV的抗性差异不明显。

桑蚕来源肠球菌的溶血性

从健康桑蚕消化道来源的肠球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｕｓ）中发现了α、β和γ（非）溶血性的菌株都有，而且β－溶血性菌株的分离比例较高（２２．５％）。这些β－溶血性菌株只在厌氧条件下得到好的表达。在ＡＰＩ２０ＳＴＰＥＰ（Ｖ．５．０）系统中这些菌株主要是一些Ｅｎｔ．ｄｕｒａｎｃｅ菌株和不能认定菌株。

三种农药混剂对家蚕的毒性评价和中毒症状观察

采用食下毒叶法,测定了3种农药混剂对家蚕的毒性,并系统观察了3种混剂处理2龄家蚕后的中毒症状。结果表明:16%高氯·杀虫单水乳剂和0.6%残杀威·高效氯氰菊酯粉剂对家蚕的LC50值小于0.15mg/L,属剧毒级药剂,对家蚕有极高风险性;68%精甲霜灵·锰锌水分散粒剂的LC50值为2.91×103mg/L,属低毒级药剂,对家蚕的风险性较低。由不同杀虫剂引起的家蚕中毒症状表现出多种相似的特征,急性中毒主要特征有吐液、拒食、身体扭曲呈"C"或"S"形、静卧等。

桑蚕丝蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳研究 Ⅱ.中部液状绢丝素的制备性电泳

本文用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,分离和制备了桑蚕中部丝腺液状绢丝素的四条区带的丝蛋色,并用氨基酸分析仪对它们的氨基酸组成进行了测定,同时与茧丝丝素进行了比较和讨论。

桑蚕丝蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳研究——Ⅲ.绢丝蛋白的等电聚焦和双向电泳

本文用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,分离和制备了桑蚕中部丝腺液状绢丝素的四条区带的丝蛋色,并用氨基酸分析仪对它们的氨基酸组成进行了测定,同时与茧丝丝素进行了比较和讨论。

家蚕促咽侧体素受体基因克隆及发育表达

文章克隆得到家蚕(Bombyx mori)神经肽促咽侧体素受体基因(Allatotropin receptor,Bommo-ATR),开放阅读框全长为1 254bp,编码416个氨基酸。Bommo-ATR氨基酸序列的二级结构预测为7次穿膜蛋白,符合GPCR家族成员的典型特征。实时荧光定量PCR结果表明,家蚕脑-咽下神经节复合体中的ATR mRNA在5龄幼虫期表达量最高,其次为蛹后期,蛹前期和成虫阶段表达量最低。其中5龄幼虫第2天表达量最高,1～5d持续维持较高的表达水平,这可能与保幼激素的合成有关。

常用家蚕原种对家蚕微粒子的胚传特性分析

家蚕微粒子病是一种危害性极大的传染性疫病,是蚕业生产上唯一的法定检疫对象.不同家蚕原种对家蚕微粒子的胚传特征分析可为家蚕微粒子病的综合防控提供理论支撑.为了充分了解现有主要实用家蚕原种对家蚕微粒子(Nosema bombycis)感染抗性的差异,本研究利用流行病学和统计学方法选择产业中近30年主要分布于四川、重庆、江苏、广西及云南常用的8个高产优质亲本品种(871、872、芙蓉932、湘753、菁松B×A、皓月B×A、苏菊和云7),分别测定其对家蚕微粒子的抗性,并分析了不同品种对家蚕微粒子的胚传规律.经研究发现8个现有生产中常用品种对微粒子抗性明显不同,当母蛾带毒程度>100时,云7的子代感染率与感染强度分别为54.4%和82,均为最低;相对于易感原种871,其子代感染率提高了21.2%,子代感染强度数值提高了34,子代感染率和感染强度的差异均十分明显;同一原种感染程度不同的母蛾胚传存在差异,一般胚传带毒与母蛾带毒呈正相关,表明母蛾带毒程度是影响子代感染率和感染强度变化的主要因素.通过掌握母蛾感染程度与胚传带毒之间的规律,可为原种间抗性差异的研究提供参考,并对家蚕微粒子防控具有重要意义.

雄蚕品种试养初报

对雄蚕蚕品种春日×平—与普通春蕾×镇珠各１０盒蚕种进行了农村对比饲养试验。结果表明：雄蚕品种在抗病性、干壳量、茧层率、出丝率、茧丝长、经济效益等方面优于普通品种。