转染BMP-2基因的兔BMSCs种植PLA/PCL支架体外构建组织工程骨

目的 :用腺病毒载体将人骨形态发生蛋白 2 (BMP 2 )基因导入兔骨髓基质干细胞 (BMSCs) ,种植PLA/PCL (聚乳酸 /聚己内酯 )支架体外构建组织工程骨。方法 :蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达 ,流式细胞仪和ALP活性检测分析基因转染对细胞增殖分化的影响。然后将转染后细胞接种到PLA/PCL支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 :转染后 ,BMSCs表达BMP 2 ,S期细胞比例和ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论 :BMP 2基因转染BMSCs ,可促进细胞增殖分化。转染后细胞在PLA/PCL支架上生长良好 ,BMP 2基因治疗的组织工程骨构建成功。

经表面修饰的β-TCP对BMSCs细胞增殖及分化作用的研究

目的研究三种材料,材料一:-磷酸三钙支架(-TCP);材料二:明胶/低结晶度羟基磷灰石涂层--磷酸三钙支架(gel/lc-HA--TCP);材料三:明胶/高结晶度羟基磷灰石涂层--磷酸三钙(gel/hc-HA--TCP)。三种材料的细胞毒性及兔骨髓基质细胞(BMSCs)与材料共培养增殖的情况。方法取兔股骨骨髓腔细胞,进行贴壁培养BMSCs。在成骨诱导液中诱导BMSCs。将诱导后的BMSCs与三种支架材料在培养板内共培养1、3、5、7、9d。采用形态学观察、MTT法及ALP检测试剂盒等方法检测材料的BMSCs细胞毒性及BMSCs细胞在材料表面的增殖和分化能力。结果光镜及电镜下观察各组无显著差异。细胞毒性在0-1级。与细胞共培养,-TCP组在第7、9天与阴性对照组差异有统计学意义。ALP检测,-TCP组在第7、9天与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.05),gel/lc-HA--TCP在第9天与阴性对照组差异有统计学意义(P<0.05)。结论新型明胶/高结晶度羟基磷灰石涂层--磷酸三钙支架和明胶/低结晶度羟基磷灰石涂层--磷酸三钙支架与BMSCs生物相容性好,适合作为支架材料负载BMSCs构建组织工程骨。

以珊瑚转化羟基磷灰石为支架材料构建组织工程骨的实验研究

目的 探讨以珊瑚转化羟基磷灰石 (CHA )作为骨组织工程支架材料的可行性 ,寻找最佳支架材料 ,为组织工程研究开辟新的途径。方法 取 4周龄兔骨髓 ,分离骨髓基质细胞 ,体外培养 ,诱导分化为成骨细胞 ,胰酶消化后离心收集细胞 ,接种至高温灭菌的 CHA材料 ,无菌条件下植入 8只裸鼠皮下组织中。对照组为同体单纯植入 CHA。分别于 6、8周取材 ,行大体观察、X线摄片及组织学染色 ,观察新骨形成情况。结果 实验组 6周时大体标本浅红色 ,X线片有较高密度阻射影像 ,组织学检查可见有新骨形成 ;8周时大体标本呈红色 ,质硬 ,X线阻射影像密度更高 ,镜下可见大量新骨形成并相互连接成骨小梁样结构 ,骨细胞位于陷窝中。对照组 8周大体标本均为白色 ,周围软组织包裹 ,X线片仅见 CHA阻射影响 ,组织学检查无新骨形成 ,为大量纤维组织长入 CHA孔洞内。结论 CHA可作为骨组织工程的支架材料 ,具有广阔的应用前景。

组织工程骨修复兔下颌骨缺损的实验研究

目的:探讨以兔骨髓基质细胞(BMSCs)为种子细胞、纳米羟基磷灰石/胶原(nHAC)为支架材料、兔自体富血小板血浆(PRP)为生长因子,构建组织工程骨修复兔下颌骨缺损能力。方法:兔下颌骨体部15mm×15mm全层骨缺损分别采取:A组,组织工程骨;B组,自体髂骨;C组,单纯nHAC材料;D组,对照组修复。术后1、3、6个月行放射性核素骨检测、骨密度测定及组织学观察。结果:放射性核素骨检测:术后1、3个月,A、B组成骨代谢能力明显优于C、D组,术后6个月时,各组之间骨代谢能力无明显差异;骨密度测定:A、B、C组骨缺损区域骨密度逐渐增加明显高于D组,术后3个月A组、B组骨密度较C组明显提高;组织学检查:A组术后1个月可见小片状类骨质出现,nHAC开始降解,术后3个月时新生骨成大片状结构,术后6个月nHAC几乎全部降解,缺损由骨组织修复,其成骨量与B组无明显差异却明显大于C组,D组仅为纤维组织修复。结论:本实验构建的组织工程骨修复颌骨缺损能力与自体髂骨相似而强于单独使用nHAC,且nHAC材料于体内可完全降解,因此BMSCs与nHAC及自体PRP复合所构建的组织工程骨是一种良好的骨缺损替代材料。

犬骨髓基质干细胞复合珊瑚羟基磷灰石皮下成骨的实验研究

目的:犬自体皮下非受力部位植入犬骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)复合珊瑚羟基磷灰石(corallinehydroxyapatite,CHA),观察成骨情况及其转归。方法:体外分离培养、成骨诱导、扩增犬BMSCs,并通过细胞化学、免疫细胞化学检测成骨表型。将第2代细胞接种于CHA上,形成细胞-材料复合物,植于9只犬右侧腹部皮下,并在对称部位植入CHA作为对照。术后4、12、26周取材,HE染色,观察新生组织结构;通过形态计量学分析,对成骨情况量化,并行t检验。结果:成骨诱导后,细胞碱性磷酸酶染色阳性,免疫细胞化学显示骨钙蛋白表达阳性。HE染色示植入4周后,无明显骨形成;12周后,实验组有较多新生骨小梁形成,苦味酸-硫堇和Masson染色示骨基质和胶原形成良好;26周后,实验组骨小梁量有减少趋势。图像分析显示,实验组12周成骨量最高,差异有统计学意义。结论:犬BMSCs诱导后具有成骨活性,复合CHA后,可促进形成组织工程化骨。在无应力刺激情况下,随时间延长,局部成骨活动减弱。

组织工程骨修复山羊负重骨大段骨缺损的长期观察

目的探讨组织工程骨修复山羊大段负重骨骨缺损的长期效果及所用支架材料珊瑚羟基磷灰石的体内最终转归情况。方法中国青山羊15只,制备单侧胫骨2cm的骨膜与骨缺损,缺损内植入组织工程骨(珊瑚羟基磷灰石+经诱导分化的骨髓基质干细胞)。术后早期行ECT、X线、组织学等手段检测,评价骨缺损修复情况。远期在术后6、12、18、24月行X线及组织学检查,评价骨缺损修复情况及珊瑚羟基磷灰石的体内转归。结果早期ECT显示在术后2个月内骨再生和再血管化进展顺利,X线和组织学显示术后组织工程骨成骨呈渐进性和偏心性;远期X线和组织学显示组织工程骨与山羊胫骨牢固愈合,并开始塑形且出现髓腔再通,珊瑚羟基磷灰石在体内逐渐成为骨基质的组成成分,自身架构消失。结论组织工程骨可以完全修复山羊大段负重骨骨缺损,形成正常骨组织并发挥功能;珊瑚羟基磷灰石最终被降解转化成骨基质。

培养人骨髓基质细胞接种多孔陶瓷再造骨组织

为探讨人骨髓基质细胞作为骨组织工程种子细胞的可行性 ,作者观察了体外培养的人骨髓基质细胞复合多孔珊瑚羟基磷灰石在体内的成骨能力。穿刺抽吸人髂骨区骨髓基质细胞 ,体外培养扩增、诱导后 ,与多孔珊瑚羟基磷灰石复合 ,植入裸鼠皮下。术后 4、8周取材 ,通过组织学检查了解植入物体内成骨情况。结果显示 ,复合物在体内成骨活跃 ,说明人骨髓基质细胞可以作为骨组织工程的种子细胞 。

3D打印PLA-HA复合材料与骨髓基质细胞的相容性研究

目的探讨骨髓基质细胞与3D打印聚乳酸-羟基磷灰石(Three-dimensional printed polylactic acid-hydroxyapatite,3D printed PLA-HA)复合支架材料的相容性,为骨组织工程选择合适的支架材料提供理论依据。方法将标记绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的骨髓基质细胞分别与3D打印PLA-HA复合材料和β-磷酸三钙(betatricalcium phosphate,β-TCP)材料体外复合培养,采用荧光显微镜观察细胞在支架材料上的生长黏附情况,并通过扫描电镜观察细胞在支架中的形态变化;CCK8(Cell Counting Kit8)法检测细胞于不同时间点在材料上的黏附率以及增殖情况;碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定法检测3 d、7 d、14 d的碱性磷酸酶活性变化。结果骨髓基质细胞能够在3D打印PLA-HA复合材料和β-TCP材料上黏附生长;β-TCP组细胞黏附率高于3D打印PLA-HA组(P<0.05),但3D打印PLA-HA组在12 h细胞黏附率可达到60%以上;细胞增殖实验显示,3D打印PLA-HA组在体外培养第4天和第7天的细胞增殖量(OD值)均高于β-TCP组与对照组(P<0.05);3D打印PLA-HA组以及β-TCP组在第3天、第7天和第14天的ALP含量均高于对照组,且3D打印PLA-HA组第7天ALP含量较β-TCP组增多(P<0.05)。结论 3D打印PLA-HA复合材料具有良好的细胞相容性,可作为骨组织工程的支架材料。

体外壳聚糖-明胶-生长因子缓释支架对骨髓间充质干细胞增殖的影响

制备具有缓释功能的壳聚糖-明胶-碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-肝细胞生长因子(HGF)三维大孔支架,探讨两种生长因子在体外对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的协同作用。方法:采用冷冻干燥法,将不同比例的壳聚糖、明胶、bFGF和HGF依次混合,使其成为具有一定孔径的三维缓释支架。取SD大鼠乳鼠股骨和胫骨骨髓,分离、培养BMSCs。取生长状态良好的第三代BMSCs,将其接种于96孔板后,加入支架混合培养,5d后进行MTT细胞增殖测定。结果:在与含1μg/mL的bFGF支架混合培养,以及与同时含1μg/mL的bFGF、1μg/mL的HGF支架混合培养后,BMSCs增殖明显(P<0.05),但这二组间无统计学差异(P>0.05)。分别与含0.1μg/mL的bFGF支架、0.01μg/mL的bFGF支架、1μg/mL的HGF支架混合培养后,细胞增殖无统计学意义(P>0.05)。结论:壳聚糖-明胶可作为生长因子缓释支架材料;bFGF具有促进BMSCs增殖的作用,促进作用的大小与加入bFGF的量有关;HGF对BMSCs不具有增殖作用;在实验浓度范围内bFGF和HGF体外促进BMSCs增殖上不具有协同性。

磷酸三钙与珊瑚羟磷灰石细胞相容性的实验研究

目的 探讨磷酸三钙 (TCP)、珊瑚羟磷灰石 (CHA)与骨髓基质细胞的生物相容性 ,为用组织工程方法修复牙周组织缺损提供依据。方法 将骨髓基质细胞分别与TCP、CHA复合体外培养 ,进行形态学观察、细胞增殖、矿化能力测定。结果 骨髓基质细胞能在TCP、CHA上贴附、生长 ,其增殖功能不受影响 ,矿化能力亦无明显变化。结论 TCP、CHA具有良好的生物相容性 ,可作为骨髓基质细胞的载体应用于牙周组织工程研究。

鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞异位成骨性能

目的 :观察鸵鸟羟基磷灰石陶瓷支架负载骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能 .方法 :获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞 ,体外分离、扩增、诱导后接种于鸵鸟羟基磷灰石支架 .支架 /细胞复合物植入裸鼠背部皮下 ,支架单纯植入作为对照 .植入后 3,6wk取材 ,通过大体、组织学观察评价成骨活性 .结果 :支架 /细胞复合物植入后 3wk ,以软骨为主的大量未成熟骨在材料表面及孔隙内形成 ;植入后 6wk ,更多的成熟骨形成 .在支架材料和骨组织的邻接区域见成骨细胞及破骨细胞 ,部分区域有血管和多核巨细胞分布 ,可见软骨内成骨方式 .结论 :支架 /细胞复合物显示良好的成骨活性 。

组织工程方法修复羊腭裂骨缺损的初步研究

目的对羊骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)复合珊瑚修复腭裂骨缺损的可行性进行初步探讨。方法体外培养扩增、成骨诱导羊BMSCs。将第3代细胞复合珊瑚修复羊完全性腭裂骨缺损,以单纯珊瑚植入缺损作为对照组。术后16周头颅CT扫描、大体观察,评价骨缺损的修复效果。结果三维CT显示,实验组可见珊瑚被新生骨替代,对照组可见珊瑚明显降解,裂隙仍然存在。大体观察显示实验组骨缺损基本愈合;对照组中珊瑚明显降解,裂隙仍然存在。结论初步证明羊BMSCs成骨诱导后与珊瑚复合能修复羊腭裂骨缺损。

骨髓基质细胞-牙根-珊瑚羟基磷灰石复合体体内再植的初步观察

目的:评价体外构建的骨髓基质细胞(BMSCs)、珊瑚-羟磷灰石支架(CHA)、牙根复合体植入体内后牙根周组织的再生情况。方法:体外分离纯化的狗BMSCs分别与牙根及CHA支架共培养形成复合体后植入体内生长,16周后取材,组织切片观察牙根周组织的再生情况。结果:实验组较对照组所不同的是:有更趋成熟、致密的牙槽骨生成;牙根与牙槽骨之间形成了清晰的软组织间隙———类牙周膜结构,主要由纤维组织、毛细血管组成。结论:BMSC-CHA-牙根复合物植入体内后有效促进牙周组织的再生;组织工程学方法促进牙周组织再生具有可行性。

纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料复合兔骨髓基质细胞异位成骨的实验研究

目的:观察nHAC/PLA复合兔BMSCs的异位成骨能力。方法:通过负压吸附使BMSCs与nHAC/PLA材料复合,将nHAC/PLA+自体BMSCs、自体BMSCs、nHAC/PLA材料分别植入新西兰兔背部肌袋内,术后4、8周通过大体、组织学观察来研究其异位成骨能力。结果:自体BMSCs组与nHAC/PLA材料组在新西兰兔背部肌袋内均无骨质形成,nHAC/PLA+自体BMSCs组8周时有大量较成熟的骨质形成,同时材料本身部分吸收。结论:通过负压吸附的方法制备出的nHAC/PLA+自体BMSCs具有良好的异位成骨能力。

冲击波诱导人骨髓基质细胞体内成骨研究

为了研究冲击波(SW)诱导人骨髓基质细胞(hMSCs)在动物体内成骨作用,根据前期工作结果,应用适宜能量冲击波(10kV,500次)处理体外培养的hMSCs,将SW组和对照组hMSCs与羟基磷灰石(HA)载体复合后体外培养2周,应用扫描电镜(SEM)检测细胞在载体表面的生长情况.将hMSCs-HA载体复合体植入裸鼠皮下,分别于术后4周、8周取材进行组织学、四环素荧光标记、SEM观察、碱性磷酸酶测定、RT-PCR检测骨钙素mRNA表达.结果表明,SW组及对照组细胞与HA载体体外复合后生长良好,且SW组细胞分泌较多的细胞基质;细胞载体复合体植入动物体内后,SW组载体表面有类骨组织形成,而对照组HA载体表面无骨组织形成;SW组与对照组的hMSCs-HA载体复合体碱性磷酸酶表达有显著性差异(P<0.01);SW组hMSCs-HA载体复合体术后4周与8周表达骨钙素mRNA,而对照组则无表达.提示hMSCs经适宜能量冲击波作用后与HA载体复合植入裸鼠体内具有成骨作用,适宜能量的冲击波作为一种新的促进hMSCs成骨分化的方法,可应用于组织工程领域.

组织工程化骨修复下颌骨缺损(附3例报告)

目的探讨以人自体骨髓基质干细胞(hBMSC)作为种子细胞的组织工程化骨在治疗肿瘤术后下颌骨缺损的可行性。方法回顾性分析2005年1月至2005年12月收治3例组织工程骨修复颌面部肿瘤术后下颌骨缺损的临床资料。抽取人骼前上棘骨髓,分离出hBMSC,经体外诱导和扩增,将hBMSC与部分脱钙骨(30%～40%)复合,于体外培养1个月后,手术植入骨缺损区。分别于术后2周、3个月、2年进行PET-CT检查随访。结果 PET-CT示,术后3个月能形成组织工程化骨,并修复了骨组织缺损,临床治疗效果稳定。结论以自体hBMSC为种子细胞,利用组织工程技术可在人体内形成稳定的组织工程化骨组织,并能修复下颌骨缺损。

FGF-2基因转染rBMSCs构建组织工程骨移植修复兔股骨头缺血性坏死模型

[目的]评价FGF-2基因转染r BMSCs构建组织工程骨移植修复兔股骨头缺血性坏死的治疗效果。[方法]采用密度梯度离心联合贴壁法体外分离、培养rBMSCs,并检测与XACB的生物相容性。用FGF-2基因过表达慢病毒转染rBMSCs,并检测FGF-2基因在rBMSCs成功过表达后,与XACB复合培养构建组织工程骨。将成功建立的激素型兔股骨头缺血性坏死模型随机分为5组:A组(control)、B组(XACB)、C组(XACB+r BMSCs)、D组(XACB+rBMSCs+Lv-GFP)、E组(XACB+rBMSCs+Lv-FGF2/GFP),进行组织工程骨移植。术后3、6、12周分点取材,进行大体解剖观察、X线片检查、HE染色评估新骨形成面积,评价该组织工程骨修复兔股骨头缺血性坏死模型的治疗效果。[结果]采用密度梯度离心联合贴壁法可获取高度均一的rBMSCs,与XACB的生物相容性良好。FGF-2基因转染rBMSCs(MOI=100),其效率在95%以上,q PCR及Western Blot检测rBMSCs可稳定过表达FGF-2。组织工程骨植入术后6周,大体标本观察及X线片检查显示E组缺损区修复面积在80%以上,术后12周缺损区完全修复,其成骨作用明显强于其他各组,而且X线评分及新骨形成面积也均高于其他各组(P<0.05)。[结论]FGF-2基因过表达慢病毒转染rBMSCs与XACB复合培养构建的组织工程骨可有效促进兔股骨头缺血坏死的修复效果。

纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸材料复合自体骨髓基质细胞修复犬下颌骨节段性缺损的实验研究

目的观察多孔块状纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸材料(nHAC/PLA)作为支架与自体骨髓基质细胞(BMSCs)复合对大动物承力骨节段性缺损的修复能力,并探讨合适的术中固定方法,为临床应用提供实验依据。方法将多孔块状nHAC/PLA加工成3.0cm×2.0cm×1.0cm的长方体状。体外培养犬髂骨来源的BMSCs,经过BrdU标记及成骨诱导后,与nHAC/PLA复合,并植入犬下颌骨3.0cm长的节段性缺损处,经过6个月的饲养,通过影像学和组织形态学观察修复骨缺损的能力。并通过免疫组织化学的方法检测种子细胞的归宿。同时设自体髂骨移植组及单纯材料植入组作为对照。结果术后6个月,下颌骨缺损区被nHAC/PLA+BMSCs复合形成的组织工程骨完全修复,形态恢复良好,大量成熟的骨组织充满缺损区的全层,材料大部分被吸收。从免疫组织化学染色结果看,组织工程骨细胞来源于种子细胞BMSCs。用钛重建板和微型钛板联合固定或单纯用钛重建板固定都可行。结论nHAC/PLA作为支架材料与自体BMSCs复合形成的组织工程骨可以修复大动物承力骨较大的节段性缺损,并可直接用钛重建板对其进行固定。

组织工程骨修复颅骨极限缺损种子细胞归宿的探讨

目的:检测纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料(nHAC/PLA,nano-hydroxyapatite/colla-gen/Polyactic acid)与骨髓基质细胞(BMSCs,bone marrow stroma cells)在体外复合构建的组织工程骨修复兔颅骨极限缺损的能力,并探讨种子细胞的归宿。方法:将圆盘状nHAC/PLA与BrdU标记的自体BMSCs复合后,植入新西兰大白兔颅骨直径1.5cm全层缺损中。设自体髂骨组、空白对照组及nHAC/PLA组,术后8w、16w通过X线片、HE染色、Masson’s三色法染色、荧光组织学和免疫组织化学染色,观察比较颅骨缺损的修复情况及种子细胞的归宿。结果:nHAC/PLA+自体BMSCs组修复颅骨缺损的能力强,与自体髂骨组类似,nHAC/PLA组材料修复骨缺损的能力较弱,但强于空白对照组,组织工程骨的成骨细胞由植入的种子细胞演化而来。结论:nHAC/PLA复合自体BMSCs具有良好的修复骨缺损能力。

新型多孔 HA/PDLLA 支架体外细胞相容性的实验研究

目的:研究新型多孔羟基磷灰石/聚乳酸(HA/PDLLA)支架材料的体外细胞相容性。方法:贴壁法培养兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),经体外矿化诱导培养、扩增后,与实验组 A(含2%HA 的 HA/PDLLA)、实验组 B(含4%HA 的 HA/PDLLA)及对照组(PDLLA)分别进行体外复合培养;并通过定性及定量检测细胞在材料表面的粘附能力、增殖活力,验证细胞材料复合体的成骨活性,比较分析各组支架材料之间的差异。结果:兔 BMSCs在三组支架材料的表面均能生长,经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节,实验组 A 与 B 细胞的粘附及增殖能力均强于对照组(P<0.05)。结论:兔 BMSCs 与新型多孔 HA/PDLLA 支架材料有良好的细胞相容性。