红景天对急性呼吸窘迫综合征小鼠肺内皮细胞BMP9表达的影响

目的探讨红景天对肺血管通透性和骨形态发生蛋白9(BMP9)表达的影响。方法将90只C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组和红景天低、中、高剂量组,每组18只。采用盲肠结扎穿孔法造模,假手术组开腹后关腹,红景天低、中、高剂量组分别用40、80、160 mg/kg红景天灌胃5 d,假手术组和模型组灌胃等量生理盐水。处死后,计算各组小鼠肺湿/干重比值,利用伊文思蓝染色法检测肺内皮细胞的渗透性,对小鼠肺组织进行免疫组化、Western blot法检测BMP9表达水平。使用脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成内皮细胞炎性损伤模型,用CCK-8法检测细胞活性,筛选出合适的红景天给药浓度。将细胞分为对照组(无LPS诱导)、LPS组和25、50、100μg/mL红景天组,应用实时荧光定量PCR和Western blot检测BMP9表达情况。结果与模型组比较,红景天低、中、高剂量组小鼠肺湿/干重比值[(7.42±0.25)、(6.75±0.25)、(5.93±0.27)比(8.39±0.39),P<0.01]和肺内皮细胞的渗透性[(620.73±0.36)%、(469.26±0.39)%、(179.20±0.36)%比(706.86±0.37)%,P<0.05或P<0.01]均显著降低,且与红景天剂量呈正相关。Western blot和免疫组化检测发现,与假手术组比较,模型组BMP9表达明显减少;而红景天低、中、高剂量组BMP9表达较模型组增加,且与剂量呈正相关。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组比较,LPS组HUVEC中BMP9 mRNA相对表达量显著下降[(0.18±0.08)比(1.00±0.11),P<0.01];与LPS组比较,红景天给药组BMP9 mRNA相对表达量随给药浓度增加而增加[(0.39±0.09)、(0.52±0.10)、(0.78±0.09)比(0.18±0.08),P<0.05或P<0.01],但均低于对照组。Western blot检测细胞BMP9蛋白表达发现,LPS诱导细胞炎性反应可以导致BMP9表达明显下降,红景天给药组的BMP9表达量均高于LPS组,且与剂量相关。结论红景天减轻了急性呼吸窘迫综合征小鼠肺损伤并在体外缓解了LPS诱导的内皮损伤,其肺血管保护作用可能与增加BMP9表达有关。

KDM4A通过下调BMP9促进乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭

背景与目的:外源性骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)能抑制人乳腺癌的恶性进展,但其在乳腺癌中常异常低表达。本研究拟探索表观遗传修饰的组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶4A(lysine specific demethylase 4A,KDM4A)在乳腺癌中的表达及作用,探究KDM4A与BMP9之间的关系及其可能的调节机制。方法:通过生物信息学方法分析KDM4A在乳腺癌中的表达及其与BMP9之间的关系,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)进行验证;采用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)验证KDM4A对BMP9的调控作用,采用RNA稳定性实验及CHX蛋白稳定性实验验证KDM4A对BMP9表达的影响。采用RNA干扰技术及敲低BMP9的腺病毒构建转染KDM4A小干扰RNA(siKDM4A)或感染siBMP9腺病毒(Ad-siBMP9)的外源性重组MDA-MB-231细胞,采用划痕愈合实验、transwell实验分别检测细胞迁移及侵袭能力。结果:生物信息学分析结果表明,KDM4A在乳腺癌中的表达明显高于正常组织,KDM4A与BMP9在乳腺癌中的表达呈负相关关系。RTFQ-PCR及Western blot结果显示,KDM4A在不同乳腺癌细胞系中均高表达,敲低KDM4A可显著上调BMP9。ChIP实验证实,KDM4A可显著富集于BMP9基因启动子区域,降低其组蛋白赖氨酸36号位而不是4号位甲基化水平,从而沉默BMP9表达。RNA稳定性实验及CHX蛋白稳定性实验证实,KDM4A对BMP9的mRNA表达无明显影响,但可影响其蛋白降解。敲低KDM4A后,乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移及侵袭能力均受到明显抑制,而这种作用可被敲低BMP9所部分逆转。结论:KDM4A在乳腺癌组织及乳腺癌细胞MDA-MB-231中高表达,并可通过下调BMP9基因启动子区域组蛋白甲基化水平沉默其表达,以及在蛋白水平而不是mRNA水平影响BMP9稳定性,促进乳腺癌的迁移和侵袭。

BMP9调控Notch、TLR4信号通路诱导主动脉瓣间质细胞成骨样分化

目的:探究骨形态发生蛋白9(BMP9)调控Notch、Toll样受体-4(TLR4)信号通路诱导主动脉瓣膜间质细胞(AVICs)成骨样分化的作用机制。方法:将患者分为非钙化性主动脉瓣疾病(non-CAVD)组和CAVD组,免疫组化和Western blot检测患者BMP9、Runx2蛋白表达水平。取健康家猪主动脉瓣叶并分离AVICs,免疫荧光染色对其进行表型鉴定;采用BMP9干扰载体及BMP9腺病毒处理AVICs,分为对照组(control组)、干扰对照组(si-control)组、si-BMP9组、携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒(Ad)组(Ad-GFP组)和Ad-BMP9组,并建立体外AVICs钙化模型;采用碱性磷酸酶(ALP)染色、雄激素受体(AR)染色检测细胞早期和晚期的成骨分化能力;qRT-PCR检测Runx2、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN) mRNA表达;Western blot检测Runx2、OPN、OCN、BMP9、Notch2、Notch胞内域(NICD)、发状分裂相关增强子1(Hes1)、TLR4、NF-κB p65蛋白表达。结果:与non-CAVD组相比,CAVD组中BMP9和Runx2蛋白明显升高(P<0.05)。原代猪AVICs分离成功,其中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Vimentin呈阳性表达,血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1,CD31)呈阴性表达。敲减BMP9后,AVICs中BMP9、Runx2、OCN、OPN mRNA水平、早期及晚期成骨分化能力及BMP9、Runx2、OCN、OPN、Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65蛋白水平均下降(P<0.05);过表达BMP9后,AVICs中BMP9、Runx2、OCN、OPN mRNA水平,早期及晚期成骨分化能力,BMP9、Runx2、OCN、OPN、Notch2、NICD、Hes1、TLR4、NF-κB p65蛋白水平均升高(P<0.05)。结论:BMP9能够促进AVICs的成骨样分化,这一作用机制可能与Notch和TLR4信号通路的激活有关。

仿生电刺激联合人工周期对卵巢储备功能减退患者子宫容受性及血清生长分化因子-9、抑制素B、骨形态发生蛋白-10水平的影响

目的探讨仿生电刺激联合人工周期对卵巢储备功能减退(DOR)患者子宫容受性及血清生长分化因子-9(GDF-9)、抑制素B(INHB)、骨形态发生蛋白-10(BMP-10)水平的影响。方法选取2019年1月至2022年3月广西壮族自治区妇幼保健院收治的87例DOR患者作为研究对象。采用随机数字表法分为A组、B组、C组,每组29例。A组采用仿生电刺激治疗,B组采用人工周期治疗,C组采用仿生电刺激联合人工周期治疗。比较三组治疗前后子宫容受性,血清GDF-9、INHB、BMP-10水平,子宫内膜血流参数及卵巢体积;随访1年,比较三组的妊娠情况;比较三组治疗期间不良反应发生情况。结果与治疗前比较,治疗后A组、B组、C组初级卵泡数、优势卵泡数、排卵数及血清GDF-9、INHB、BMP-10水平均升高,卵巢体积均增大,且A组、B组、C组呈增高趋势(P<0.05)。与治疗前比较,治疗后A组、B组、C组子宫内膜血流搏动指数(PI)、子宫内膜血流阻力指数(RI)均减小,且A组、B组、C组呈下降趋势(P<0.05)。随访1年,C组妊娠率高于A组、B组(P<0.05)。治疗期间,三组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论仿生电刺激联合人工周期可提高DOR患者子宫容受性,改善子宫内膜血流参数及卵巢体积,也可改善血清GDF-9、INHB、BMP-10水平,提高自然妊娠率,且安全性好。

特发性矮小症患儿血清BMP9、SMAD3表达与生长发育和骨龄相关指标的关系

目的探讨特发性矮小症(ISS)患儿血清骨形态发生蛋白(BMP)9和果蝇母亲对抗脑脊髓瘫痪蛋白(SMAD)3水平与生长发育和骨龄相关指标的关系。方法选取2020年9月至2022年9月青岛市第八人民医院收治的ISS患儿110例作为ISS组,同期选取110例该院的体检健康儿童作为对照组,比较两组血清BMP9、SMAD3水平。采用Pearson相关分析BMP9、SMAD3水平与ISS患儿性发育状态、身高、体重、体重指数(BMI)、骨钙素(Ost)、瘦素(Leptin)、骨龄指数(BAI)、骨龄年龄差(BAD)的相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析BMP9、SMAD3对ISS的诊断价值。采用多因素Logistic回归分析影响ISS发生的因素。结果与对照组比较,ISS组血清BMP9水平升高,SMAD3水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组与ISS组性发育状态、BMI、BAI、BAD及Ost、Leptin水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果显示,ISS患儿BMP9水平与SMAD3、性发育状态、身高、体重、BMI、Ost、Leptin、BAI、BAD均呈负相关(r=-0.497、-0.523、-0.447、-0.486、-0.501、-0.465、-0.502、-0.434、-0.520,P<0.05);血清SMAD3水平与性发育状态、身高、体重、BMI、Ost、Leptin、BAI、BAD均呈正相关(r=0.432、0.458、0.431、0.465、0.503、0.467、0.515、0.527,P<0.05)。ROC曲线分析显示,BMP9、SMAD3联合检测ISS的曲线下面积高于二者单独检测(Z=2.774、2.958,P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,血清BMP9水平是影响ISS发生的独立危险因素,SMAD3水平为独立保护因素(P<0.05)。结论ISS患儿血清BMP93水平升高,SMAD3水平降低,并且二者与ISS患儿生长发育和骨龄相关指标密切相关,可作为评估ISS患儿病情的分子标志物。

炎症微环境作用下BMP9通过ERK5/KLF4信号通路促进牙周膜干细胞成骨分化

目的:探讨骨形态蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)在炎症环境中是否通过ERK5/KLF4信号通路促进牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化。方法:利用重组腺病毒技术,在TNF-α刺激的PDLSCs中过表达BMP9,通过RT-PCR和Western印迹法检测成骨相关基因及蛋白的表达变化。随后,通过转染技术使KLF4在PDLSCs中过表达,在炎症条件下观察其对成骨分化及相关基因表达的效应。在KLF4敲低的背景下过表达BMP9,观察其对成骨分化的影响。添加ERK5抑制剂BIX02189,揭示ERK5在BMP9诱导的成骨分化中的关键作用。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果:BMP9在炎症环境下显著促进PDLSCs成骨分化,并增强KLF4表达。KLF4过表达进一步加强了PDLSCs成骨分化。然而,当KLF4被敲低时,BMP9对PDLSCs成骨促进效应受到明显抑制。BMP9处理显著增加ERK5磷酸化水平,但在ERK5被抑制后,BMP9对成骨分化的促进效应大幅减弱。结论:BMP9可在炎症环境中通过ERK5/KLF4信号通路显著促进PDLSCs成骨分化。

血清骨形态发生蛋白9与生长分化因子15水平在脓毒症诊断及预后评估中的价值

目的:探讨血清骨形态发生蛋白9(BMP9)与生长分化因子15(GDF15)表达在脓毒症诊断和预后评估中的价值。方法:收集脓毒症患者30例作为脓毒症组,非脓毒症重症患者31例为非脓毒症组,同期体检的健康成人23例为对照组。追踪随访脓毒症组患者28d转归,分为存活组16例和死亡组14例。分析比较3组一般资料、临床指标及血清BMP9与GDF15水平。采用Logistic回归分析脓毒症发病及预后的危险因素。通过受试者工作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)评估血BMP9及GDF15在脓毒症诊断及预后预测中的价值。结果:与非脓毒症组和对照组比较,脓毒症组血清BMP9表达明显增高(P均<0.05)。与对照组比较,脓毒症组血清GDF15表达明显增高(P<0.05)。脓毒症死亡组患者血清BMP9、GDF15水平显著高于存活组(P均<0.05)。Logistic回归示血BMP9、C反应蛋白(CRP)、序贯器官衰竭评分(SOFA)是脓毒症发病的独立危险因素,GDF15是脓毒症患者死亡的独立影响因素。BMP9联合CRP诊断脓毒症的AUC为0.845,特异性83.9%,灵敏度73.3%,诊断效能与序贯器官衰竭评分相当(AUC 0.809,特异性83.9%,灵敏度70.0%)。GDF15联合中性粒细胞与淋巴细胞的比值(NLR)对脓毒症患者预后预测的AUC为0.898,特异性80%,灵敏度100%,预测效能与急性生理与慢性健康状况评估(APACHE II)评分相当(AUC 0.687,特异性93.9%,灵敏度53.3%)。结论:脓毒症患者BMP9和GDF15表达明显增高,BMP9联合CRP对脓毒症诊断价值较高。GDF15联合NLR对脓毒症患者预后预测效能较高。

骨形态发生蛋白9对肝细胞癌肿瘤干细胞干性、增殖和侵袭的影响及机制

目的探讨骨形态发生蛋白9(BMP9)对肝细胞癌(HCC)肿瘤干细胞(CSCs)干性、增殖和侵袭的影响及机制。方法取对数生长期的正常肝细胞、肝癌细胞、肝癌CSCs,采用RT-qPCR法检测BMP9 mRNA表达,采用Western blotting法检测BMP9蛋白表达。采用慢病毒干扰载体转染肝细胞癌肿瘤干细胞(HepG2-CSCs)以敲低BMP9表达,并分成HepG2-CSCs组、HepG2-CSCs-BMP9敲低组。加入MAPK/ERK信号激动剂(DIPQUO)后,将细胞分为三组:HepG2-CSCs组、HepG2-CSCs敲低组及HepG2-CSCs敲低+DIPQUO组。采用RT-qPCR实验检测HepG2-CSCs干性相关分子CD44、SOX2和OCT4表达,采用CCK-8实验检测细胞增殖能力,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力,采用蛋白印迹法检测MAPK/ERK通路关键蛋白表达。结果与正常肝细胞比,肝癌细胞和肝癌肿瘤干细胞(HepG2-CSCs)中BMP9表达上调(P<0.05)。HepG2 CSCs细胞中BMP9 mRNA和蛋白表达高于HepG2细胞(P均<0.05)。BMP9敲低后,HepG2-CSCs-BMP9敲低组中HepG2-CSCs细胞中干细胞相关标志物CD44、SOX2、OCT4 mRNA表达较HepG2-CSCs组降低(P均<0.05)。与HepG2-CSCs组比较,HepG2-CSCs-BMP9敲低组中HepG2-CSCs在48、72和96 h的细胞增殖能力降低(P均<0.05),HepG2-CSCs细胞迁移和侵袭能力降低(P均<0.05)。较HepG2-CSCs组,HepG2-CSCs-BMP9敲低组中HepG2-CSCs中p-ERK1/2和p-MEK1/2蛋白表达显著降低(P均<0.05)。HepG2-CSCs敲低+DIPQUO组HepG2-CSCs中干细胞相关标志物CD44、SOX2、OCT4 mRNA表达增加(P均<0.05),HepG2-CSCs增殖和侵袭能力增强(P均<0.05)。结论BMP9敲低可抑制HepG2-CSCs干性维持并抑制细胞增殖、降低侵袭能力,机制可能与抑制MAPK/ERK信号通路有关。

缺氧诱导因子-1α调控骨形态发生蛋白9对间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导间充质干细胞(MSCs)C3H10T1/2成骨分化的影响。方法体外培养小鼠MSCs C3H10T1/2细胞系,分为5组:NC组(正常培养C3H10T1/2细胞)、Ad-GFP组(转染腺病毒液)、Ad-BMP9组(转染BMP9过表达的腺病毒液)、pcDNA3.1-mRFP组(转染Ad-BMP9+pcDNA3.1空载质粒)、pcDNA3.1-HIF-1α组(转染Ad-BMP9+HIF-1α过表达质粒)。采用碱性磷酸酶(ALP)显色及活性检测试剂盒检测各组C3H10T1/2细胞中ALP活性;采用茜素红S染色检测各组C3H10T1/2细胞钙盐沉积情况,并用吸光度(A)值进行定量分析;采用免疫印迹法检测各组C3H10T1/2细胞中BMP9、HIF-1α及成骨分化标志物骨钙素(OC)、骨桥蛋白(OPN)及Runt相关转录因子2(Runx2)蛋白表达。结果与NC组、Ad-GFP组比较,Ad-BMP9组ALP活性、钙盐沉积、A值及BMP9、HIF-1α、OC、OPN、Runx2蛋白表达增加(P<0.05)。与Ad-BMP9组、pcDNA3.1-mRFP组比较,pcDNA3.1-HIF-1α组ALP活性、钙盐沉积、A值及BMP9、HIF-1α、OC、OPN、Runx2蛋白表达增加(P<0.05)。结论HIF-1α可促进BMP9诱导MSCs C3H10T1/2成骨分化,可能与上调OC、OPN及其下游Runx2蛋白表达有关。

Wnt3a协同BMP9调控间充质干细胞成骨分化及机制研究

目的:探讨经典Wnt信号通路与骨形态发生蛋白9(Bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞(Mes-enchymal stem cells,MSCs)成骨的相互影响及分子机制。方法:以小鼠骨髓来源MSCs C3H10T1/2为目的细胞,用Wnt3a上调经典Wnt信号通路,联合BMP9作用于细胞,通过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定、钙盐沉积实验、real time PCR、免疫细胞化学染色等方法观测BMP9与经典Wnt信号通路联合后对MSCs成骨分化的影响。结果:Wnt3a明显促进了BMP9诱导的ALP活性的增加[F=264.962,P=0.000;t(BMP9+Wnt3a)-BMP9=7.19,P=0.000;t(BMP9+Wnt3a)-Wnt3a=16.36,P=0.000],同时也明显增加了成骨标志物骨钙蛋白(Osteocalcin,OC)[F=3 920.102,P=0.000;t(BMP9+Wnt3a)-BMP9=39.10,P=0.000;t(BMP9+Wnt3a)-Wnt3a=62.56,P=0.000]和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)[F=1 935.824,P=0.000;t(BMP9+Wnt3a)-BMP9=40.88,P=0.000;t(BMP9+Wnt3a)-Wnt3a=56.42,P=0.000]的表达以及Runx2的mR-NA的表达[F=3 635.980,P=0.000;t(BMP9+Wnt3a)-BMP9=79.37,P=0.000;t(BMP9+Wnt3a)-Wnt3a=86.96,P=0.000],并且还促进了钙盐沉积。结论:Wnt3a与BMP9相互协同诱导MSCs的骨向分化,其中成骨转录因子Runx2可能作为二者的交汇点起了重要作用。

激活Shh信号通路促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化

近年来骨组织工程技术迅猛发展,小鼠成肌细胞C2C12因其来源广泛等优点可望成为有效的种子细胞应用于组织工程.然而,对于C2C12细胞的成骨分化机制仍需深入研究.为了观察Sonic hedgehog(Shh)信号通路对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的C2C12细胞成骨分化的影响,构建过表达腺病毒Ad-Shh,并作用于BMP9处理的C2C12细胞,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的变化,茜素红S染色检测钙盐沉积,RT-PCR检测Shh、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runx2、Dlx5、Id1和Id2基因表达,Western印迹检测Shh、OPN、OCN、Runx2和Dlx5的蛋白质表达,Micro-CT和H&E染色检测裸鼠皮下异位成骨包块情况.结果表明,活化Shh信号通路可促进BMP9诱导的C2C12细胞早晚期成骨分化,以及裸鼠皮下异位成骨.体内外实验证明,Shh信号通路能促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化.

BMP9经JNK激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

为了证实JNK激酶在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用,利用重组腺病毒将BMP9导入间充质干细胞C3H10T1/2.通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定、钙盐沉积实验、荧光素酶报告基因检测、Western印迹和组织化学染色等方法,检测BMP9是否可经JNK激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化.动物实验验证在RNA沉默JNK蛋白激酶后,对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化的影响.结果发现,BMP9可以增强JNK激酶的磷酸化;利用JNK抑制剂SP600125抑制JNK激酶活性后,BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2的早期成骨指标ALP活性和晚期指标钙盐沉积均受到抑制,而且经典SMAD信号的活化也相应受到抑制;RNA干扰沉默JNK基因表达后,同样也可抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性和裸鼠皮下异位成骨.因此表明,BMP9可活化JNK激酶途径从而诱导间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化.

过表达BMP9对人肺鳞状细胞癌细胞NCI-H520迁移和侵袭的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)对人肺鳞状细胞癌细胞NCIH520迁移和侵袭的影响及其机制。方法:采用RT-PCR和Western blot法分别检测NCI-H520细胞和正常人支气管上皮(HBE)细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达水平;用Ad BMP9感染NCI-H520细胞,RT-PCR和Western blot法验证BMP9的变化;应用划痕愈合实验检测各组细胞的迁移能力,Transwell小室检测迁移和侵袭能力,并用RTPCR和Western blot法检测迁移相关因子基质金属蛋白酶2(MMP2)的mRNA和蛋白水平。Western blot法检测BMP-Smad经典通路中Smad1/5的磷酸化水平(p-Smad1/5)。用BMP特异性拮抗剂Ad Noggin与Ad BMP9共处理NCI-H520细胞,检测p-Smad1/5及细胞迁移能力的变化。结果:BMP9在NCI-H520细胞中的mRNA和蛋白水平均比在HBE细胞中低;Ad BMP9感染的NCI-H520细胞中BMP9的mRNA和蛋白水平均明显升高,细胞迁移和侵袭能力均明显下降,MMP2的mRNA和蛋白水平下降,且p-Smad1/5的表达水平明显上调。在NCI-H520细胞中,Noggin能有效逆转BMP9导致的p-Smad1/5升高和细胞迁移抑制能力。结论:外源性BMP9转入肺鳞癌细胞NCI-H520可明显抑制其迁移侵袭的能力,该抑制作用可能与BMP-Smad信号通路的激活有关。

ERK5和JNK参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化

目的研究细胞外信号调节激酶5(ERK5)和c-Jun N端激酶(JNK)在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化中的作用。方法利用重组腺病毒将BMP9基因导入C3H10T1/2细胞,Western blot法检测加入BMP9及不同浓度ERK5特异性抑制剂BIX02189或JNK特异性抑制剂SP600125后ERK5和JNK的激活情况;实时定量PCR(qRT-PCR)检测BMP9诱导1周后心肌特异性基因肌细胞增强因子2C(MEF2C)、GATA结合蛋白4(GATA4)表达;Western blot法检测经BMP9诱导3周后心肌特异性蛋白缝隙连接蛋白43(CX43)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达和免疫荧光技术检测CX43、cTnT在细胞内的表达。结果在转染效率达50%左右的情况下,BMP9可过度激活ERK5和JNK,使其磷酸化水平显著增高(P<0.05);BIX02189抑制ERK5激活后,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的心肌分化标志物MEF2C、GATA4、CX43、cTnT均受到显著抑制(P<0.05),JNK特异性抑制剂SP600125也可抑制MEF2C、GATA4、CX43、cTnT表达,但对MEF2C及GATA4的抑制不如BIX02189显著(P<0.05)。结论 ERK5和JNK的过度激活参与了BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞的分化。

ATRA与BMP9对人骨肉瘤细胞增殖及分化作用的研究

目的研究全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)与骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)对人骨肉瘤细胞增殖及分化的影响。方法利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞仪分析细胞增殖情况;蛋白质免疫印迹实验(Western blot)检测细胞增殖和成骨相关指标;半定量PCR及Western blot分析ATRA和ATRA与BMP9联用处理143B细胞株后对BMP9表达水平的影响。结果在人骨肉瘤143B细胞株中,与对照组相比,ATRA能明显抑制细胞增殖(P<0.05),并促使细胞周期阻滞在G1期(P<0.05),下调PCNA的蛋白水平,并呈浓度依赖性;ATRA能呈浓度依赖性增加晚期成骨指标OCN和OPN的蛋白水平(P<0.05);ATRA能上调BMP9的m RNA及蛋白水平,并呈浓度依赖性(P<0.05);单用BMP9并不能上调OCN和OPN表达,并促进其增殖(P<0.05),但与ATRA联用时,能够增强ATRA诱导的相关成骨指标表达和抗增殖作用(P<0.05)。结论ATRA对143B细胞的增殖具有抑制作用并诱导其成骨分化,并可能恢复BMP9的成骨诱导能力。

过表达miR-30a抑制BMP9诱导C2C12细胞的成骨分化

目的探讨miR-30a在BMP9诱导间充质干细胞C2C12成骨分化中的作用。方法 BMP9条件培养基处理间充质干细胞C2C12诱导成骨分化,用real-time PCR连续检测miR-30家族成员的mRNA。用BMP9条件培养基作用Ad-mmu-miR-30a预处理的C2C12细胞,通过ALP染色和活性检测来反映早期成骨指标ALP的表达、分别在mRNA水平和蛋白水平检测中期成骨指标(OCN)的表达、用钙盐沉积来检测晚期成骨分化,用流式细胞术和MTT检测C2C12细胞的周期与增殖。最后探讨miR-30a在BMP9诱导C2C12细胞成骨分化中的作用机制。结果 miR-30家族中,只有miR-30a在BMP9诱导C2C12细胞成骨分化中表达下调,miR-30a过表达后,通过靶基因Runx2使BMP9诱导成骨分化能力减弱,ALP的表达下降(P<0.05),OCN蛋白水平和mRNA水平也都表达下调(P<0.05),钙盐沉积受到抑制。结论 miR-30a可以抑制BMP9诱导C2C12细胞的成骨分化。

孤儿核受体SHP敲减抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化

孤儿核受体SHP(small heterodimer partner)是核受体超家族中的一员,具有LXXLL模体及配体结合域,但无经典的DNA结合域.它可与多种转录因子结合,调节细胞的增殖、分化和代谢等生物学过程.但目前关于SHP在BMP9诱导成骨分化中的确切作用却尚不清楚.本研究证明,SHP参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化.RT-PCR结合Western印迹方法检测蛋白揭示,异位表达BMP9上调了SHP在C3H10T1/2细胞中的表达.小干扰RNA敲减SHP基因在C3H10T1/2细胞的表达下调了成骨相关基因Runx2、Id1、Id2及CTGF的表达,而过表达BMP9则可上调这些基因的表达.碱性磷酸酶(ALP)活性测定/染色及茜素红染色显示,敲减核受体SHP基因可抑制BMP9的成骨分化作用,而过表达BMP9可部分消除SHP敲减导致的成骨抑制作用.上述结果提示,核受体SHP为BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化所必需.究竟BMP9如何上调SHP基因表达,以及SHP究竟通过何种机制上调BMP9下游成骨分化相关基因的表达尚待进一步研究.

BMP9和VEGF联合诱导小鼠间充质干细胞成骨分化的体外研究

目的:探讨重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)共感染对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响。方法:将重组腺病毒介导的BMP9和VEGF分5组感染小鼠间充质干细胞C3H10T1/2,Ad-BMP9组、Ad-VEGF组、AdVEGF+Ad-BMP9组、空载体腺病毒组和空白组,感染7 d后,real-time PCR检测BMP9和VEGF的m RNA水平,real-time PCR检测成骨指标骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的m RNA水平,Western blot检测OPN蛋白的表达,各组细胞行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的定量检测、ALP染色和钙盐沉积的检测。结果:BMP9和VEGF在Ad-VEGF+Ad-BMP9组高效共表达,OC、OPG、OPN m RNA水平和OPN蛋白水平在Ad-BMP9组和Ad-VEGF+Ad-BMP9组的表达明显高于其他各组(P﹤0.05),且在Ad-VEGF+Ad-BMP9组表达最高(P﹤0.05)。Ad-VEGF+AdBMP9组的ALP活性、ALP染色和钙盐沉积明显高于其他各组(P﹤0.05)。结论:联合VEGF可明显增强BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化能力。

ERK5信号通路参与BMP9诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞的分化

目的:研究细胞外信号调节激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)信号通路在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化中的作用。方法:用AdBMP9和AdGFP转染C3H10T1/2细胞,流式细胞术检测转染效率,Western blot检测磷酸化ERK5(phosphorylation ERK5,p-ERK5)和ERK5的表达水平,免疫荧光检测p-ERK5在细胞内的表达位置;ERK5特异性抑制剂BIX02189预处理细胞再经AdBMP9诱导,Western blot检测pERK5和ERK5表达水平,RT-qPCR检测心肌特异性基因肌细胞增强因子(myocyte enhancer factor,MEF)2C、GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)表达,Western blot检测心肌特异性蛋白缝隙连接蛋白43(connexin 43,CX43)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)表达。结果:AdGFP与AdBMP9的转染效率达50%左右,经AdBMP9诱导后的细胞p-ERK5表达明显增高(P<0.01),免疫荧光结果显示BMP9组p-ERK5表达明显增强且主要集中于胞核;15μmol/L BIX02189可完全抑制pERK5的表达(P<0.01),且明显降低了由AdBMP9诱导的C3H10T1/2细胞GATA4、MEF2C基因与CX43、cTnT蛋白表达(P=0.000)。结论:BMP9可以通过激活ERK5信号通路调控C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化。

AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨

目的:研究转录蛋白2(activator protein 2,AP2)α在骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制。方法:重组腺病毒Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△b HLH和AP2α-△TAD抑制AP2α转录活性,通过RT-PCR、real-time PCR检测AP2α、BMP9及成骨相关基因的表达水平,Western blot检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、茜红素染色实验观测C3H10成骨分化。结果:BMP9具有强促成骨分化的作用,对AP2α的表达水平无影响,AP2α显性负性突变体可抑制BMP9诱导的成骨基因骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、OPN及骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的增高(OC:F=56.929,P=0.000;OPN:F=54.789,P=0.000;OPG:F=159.451,P=0.000),ALP活性(F=69.776,P=0.000)及红色钙盐沉积减少。结论:BMP9可能通过影响AP2α的转录活性调控成骨分化进程。