人骨形态发生蛋白2基因治疗大鼠牙槽骨缺损的实验研究

目的:观察重组腺相关病毒(rAAV)介导的人骨形态发生蛋白2(hBMP2)对大鼠实验性牙槽骨缺损的修复作用。方法:将30只实验大白鼠随机分为实验组和对照组。在两组动物下颌1 1牙间牙槽骨人工制备2mm×2mm骨缺损区。实验组骨缺损区植入浸有携目的基因hBMP2和标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺相关病毒液(rAAV-hBMP2-GFP)的明胶海绵块,对照组植入只浸有携GFP的空病毒液(AAV-GFP)的明胶海绵块。术后15d、30d、60d分别处死动物,进行放射学和组织学观察。结果:1两组样本牙槽骨缺损处的骨密度值随时间的增加而增高;在15d、30d、60d,实验组样本牙槽骨缺损处骨密度值(0.062,0.236,0.456)均高于对照组(0.054,0.158,0.216),其中30d、60d两组有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。2术后15d两组样本牙槽骨缺损处周边组织均可见到GFP;术后30d、60d,实验组样本较对照组绿色荧光强度明显加强。3实验组:术后15d,牙槽骨人工缺损区周围成纤维细胞和毛细血管生长活跃,周边有骨样组织和少量的骨组织形成。术后30d,骨缺损处新骨数量增多。术后60d,缺损区几乎被新生骨组织充满;对照组:术后15d可见少量炎性细胞,成纤维细胞和毛细血管生长活跃;术后30d,骨缺损区周边可见成骨细胞和少量骨样组织;术后60d,骨缺损区边缘有少量新骨沉积,腔内被纤维组织充满。结论:rAAV-hBMP2-GFP成功修复大鼠实验性牙槽骨缺损。

骨形态发生蛋白7局部基因治疗和组织工程化骨对大鼠脊柱融合的影响

目的评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白7（Ad-hBMP-7）基因转染的骨髓间充质干细胞（BMSCs）和纳米羟基磷灰石/胶原复合材料（NHAC）复合后对脊柱融合的影响。方法抽取大鼠骨髓获得BMSCs,应用Ad-hBMP-7转染大鼠BMSCs,将NHAC材料和密度为2×105/ml的Ad-BMP-7转染大鼠的BMSCs细胞孵育2h后备用;Wistar大鼠56只,随机分成4组,建立脊柱后外侧融合模型,分别植入自体髂骨（A组）、NHAC材料（B组）、NHAC材料和BMSCs（C组）以及Ad-hBMP-7-BMSCs与NHAC材料混合物（D组）。每组行RT-PCR及Western blotting检测,8周和12周后分别行X线摄片,并对标本进行手触检测硬度、生物力学检测和组织学观察。结果D组10只大鼠的脊柱L4/5节段全部融合;A组12周0例融合;B组12周0例融合;C组12周3例融合。D组同A、B、C组结果相比均有显著性差异（P＆lt;0.001）。结论BMP-7局部基因治疗和组织工程化骨能促进脊柱融合。

NF-κB p65介导的前列腺素E2分泌及DNA结合抑制因子2蛋白表达在促进大鼠桡骨骨折早期愈合的作用

目的骨再生过程包含一系列复杂的分子信号途径,通过探讨NF-κB作为骨折愈合过程中"关键性激活点"的可能性,为基因治疗骨折延迟愈合和骨不连提供实验依据。方法取6～7周龄Wistar雄性大鼠33只,体重180～220 g,随机分为4组。对照组(A组,n=3)、单纯NF-κB抑制剂Bay 11-7082处理组(B组,n=6):分别在大鼠右前肢桡骨中下段经皮注射0.3 mL生理盐水或含50μmol/L Bay 11-7082的生理盐水,每天1次,持续至处死。单纯骨折组(C组,n=12)、Bay 11-7082干预骨折组(D组,n=12):制备右侧桡骨中下段骨折模型后,C组不作任何处理,D组处理方法同B组。观察大鼠一般情况,A组于注射后7 d,B、C、D组于注射后3、7 d取标本行ALP活性、前列腺素E2(prostaglandins E2,PGE2)含量检测以及Western blot检测NF-κB p65、BMP-7和DNA结合抑制因子2(inhibitor of DNA binding 2,Id2),并取C、D组14、28 d标本行HE染色观察。结果各组大鼠均存活至实验完成。注射后3、7 d B组ALP活性及PGE2含量与A组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);C组较A组增高,D组较A组降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。注射后3、7 d,各组骨折端组织中均见NF-κB p65、BMP-7、Id2表达,B组各因子表达水平与A组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);C组NF-κB p65和BMP-7蛋白表达水平较A组增高,Id2蛋白表达水平较A组降低,差异均有统计学意义(P<0.01);D组NF-κB p65、BMP-7蛋白表达水平较A组降低,Id2蛋白表达较A组增高,差异均有统计学意义(P<0.01)。组织学观察示,注射后14、28 d C组骨折端组织见大量骨性骨痂,而D组28 d时才见骨性骨痂。结论 NF-κB p65可通过调控PGE2分泌以及BMP-7和Id2蛋白表达促进大鼠桡骨骨折的早期愈合。

负载BMP-2质粒的脂多糖胺纳米囊泡转染大鼠BMSCs的研究

目的应用脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs)作基因载体,评价其与目的基因复合及其在BMSCs中的转染情况,为LNPs介导的基因联合干细胞治疗骨缺损提供初步实验依据。方法制备加载了BMP-2质粒(plasmid of BMP-2,pBMP-2)的LNPs(plasmid-loaded LNPs,pLNPs);通过凝胶阻滞实验探究pLNPs与pBMP-2结合能力随pLNPs中N元素和P元素比例(N/P)变化的关系;透射电镜及原子力显微镜下观察pLNPs(N/P=60)形貌;动态光散射仪检测其粒径及Zeta电位;探究pLNPs耐酶解能力随时间的变化规律;体外转染大鼠BMSCs,探究不同N/P条件下pLNPs转染后细胞存活率、转染效率,及最佳N/P条件下pLNPs转染BMSCs表达目标蛋白情况。结果当N/P≥1.5时,pLNPs可完全阻滞pBMP-2;N/P为60时,pLNPs在原子力显微镜下呈大小均一囊泡状,透射电镜下pLNPs呈典型的类球形空心囊泡状,直径(72.07±11.03)nm;pLNPs粒径为(123±6)nm,Zeta电位为20 mV;pLNPs在4 h内耐DNaseⅠ酶解,6 h时对核酸保护能力稍下降。细胞存活率随N/P增加呈先增加后降低趋势,N/P为45时达最大值,N/P≤90时细胞毒性分级为1级,可用于体内实验;pLNPs转染效率随N/P增加而增大,N/?P为60时达最大值;综合确定最佳N/P为60。在N/P为60转染BMSCs条件下,4 d内细胞持续高表达BMP-2。结论LNPs能高效压缩pBMP-2形成复合物纳米囊泡,保护目的基因不被酶解,较聚乙烯亚胺25k和Lipofectamine 2000有更高的转染效率及蛋白表达量。