禽波氏杆菌外膜蛋白的提取及其免疫原性的检测

为研究禽波氏杆菌OMP的免疫原性,试验采用超声波破碎、TritonX-100处理技术提取了禽波氏杆菌OMP,采用Bradford方法测定禽波氏杆菌OMP含量,进行了SDS-PAGE检测,然后制备油乳剂OMP免疫抗原,对1日龄雏鸡分别以0.3mL(OMP90μg)、0.5mL(OMP150μg)、0.8mL(OMP240μg)的剂量颈部皮下接种。结果:禽波氏杆菌OMP含量为300μg/mL;禽波氏杆菌OMP最佳免疫剂量为0.5mL/只;通过免疫抗体与攻毒保护相关性测试,抗体效价在1:28以上能抵抗致死量禽波氏杆菌的攻击。据间接ELISA法检测的抗体水平可知,抗体的持续时间足以保护雏鸡避过易感日龄,试验发现OMP具有良好的免疫原性。本试验结果将为禽波氏杆菌OMP单克隆抗体的制备、快速诊断试剂盒的研制、亚单位疫苗的开发奠定良好的基础。

鸡胚胎性病原菌多重PCR检测方法的建立

为建立同时检测禽波氏杆菌(Bordetella avium)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)4种导致鸡胚死亡病原菌的多重PCR方法,本研究根据B.avium的ompA基因、Salmonella的invA基因、E.coli的phoA基因和P.aeruginosa的toxR基因序列,各设计一对特异性引物进行多重PCR反应,并对反应体系和条件进行优化。结果显示,4对引物分别扩增出597bp、724bp、372bp和278bp的目的条带;并且特异性强不与其他非目的菌发生反应。经优化B.avium、P.aeruginosa和E.coli多重PCR检测灵敏度达到104cfu/mL,而Salmonella为103cfu/mL。本研究建立的多重PCR方法为相关病原菌的快速检测提供方法。

禽波氏杆菌分离株的16S rRNA基因序列分析

采用PCR方法对本实验室分离保存的10株禽波氏杆菌、3株兔支气管败血波氏杆菌及1株猪支气管败血波氏杆菌菌株,扩增其16SrRNA基因的5′端片段(783bp),并测定所得片段的DNA序列。用DNAStar分析软件将所获得的序列与GenBank中的禽波氏杆菌序列进行比较,由此构建禽波氏杆菌菌株的系统发育树。结果显示,10株禽波氏杆菌核苷酸序列与GenBank中收录的AF177666株禽波氏杆菌核苷酸序列的同源性为82.0%～82.5%,与兔支气管败血波氏杆菌和猪支气管败血波氏杆菌核苷酸序列的同源性均为99.2%～99.9%,其中P9(山鸡波氏杆菌)、P11(兔支气管败血波氏杆菌)与P14(猪支气管败血波氏杆菌)分别发生1个核苷酸的缺失。本试验结果表明,16SrRNA序列分析是鉴定禽波氏杆菌的一种快速而准确的方法。

禽波氏杆菌免疫荧光检测和抗体检测ELISA方法的建立与应用

采用改良的Wooldridge法提取了禽波氏杆菌外膜蛋白(OMP),通过Bradford方法测定禽波氏杆菌OMP含量为320μg/mL,SDS-PAGE电泳检测发现禽波氏杆菌P5株OMP含有5种成分,相对分子质量分别为58、47、41、36、24 ku;P8株OMP含有6种成分,相对分子质量分别为58、47、41、38、211、6 ku。将提取的禽波氏杆菌OMP免疫健康青紫兰兔,每周免疫1次,共免疫4次,获得了兔抗禽波氏杆菌OMP高免血清,以此高免血清建立了检测禽波氏杆菌的间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)方法,并对其工作条件进行了优化和筛选,试验结果表明间接ELISA抗原、抗血清最佳工作浓度分别为10μg/mL、1∶12 800,酶标二抗工作浓度为1∶5 000,最佳包被条件为4℃2、4 h,最佳封闭条件为37℃1、h;间接免疫荧光(IFA)兔高免血清释释度为1∶20,FITC标记羊抗兔IgG稀释度为1∶10,感作时间为45 min时,禽波氏杆菌特异性黄绿色荧光最清晰,非特异性荧光最弱。经临床检测证明该两种方法均具有简便、快速、特异性强的特点,为禽波氏杆菌病的流行病学、血清学调查和临床快速诊断奠定了基础。

禽波氏杆菌外膜蛋白A的克隆测序与生物信息分析

本文旨在克隆禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA的编码基因,并预测OmpA蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA在免疫保护中所起的作用。作者对禽波氏杆菌的外膜蛋白ompA基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对禽波氏杆菌OmpA蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。禽波氏杆菌ompA基因全长597bp,编码199个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和β-片层,少见β-转角;推测OmpA蛋白有5个B细胞优势抗原表位区域、2个糖基化位点。本研究为进一步分析禽波氏杆菌免疫机理、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定理论基础。

禽波氏杆菌内毒素致病性的研究

本研究利用热酚水法从营养琼脂培养基上生长的禽波氏杆菌菌苔提取其内毒素精品 ,用此提取物通过家兔Shwartzman试验及鸡胚、雏鸡和小白鼠接种试验 ,对禽波氏杆菌内毒素的致病性进行研究探讨。试验结果表明 :该内毒素对鸡胚、小白鼠的致病性较强 ,而雏鸡、家兔具有较强的抵抗力 ,但各种发病死亡动物的病变特征、病变性质、致死原因基本一致 ,均表现为急性败血症性病变 ,心、肝、肾、肺等多器官功能急性衰竭是致死动物的主要原因。

网状内皮组织增殖病病毒免疫抑制状态下禽波氏菌对雏鸡致病性增强

禽波氏菌可引起禽类的高度接触性上呼吸道疾病,且经常与免疫抑制性病毒发生共感染。为研究免疫抑制状态下禽波氏菌致病性的变化,试验中以网状内皮组织增殖病病毒(REV)感染鸡胚构建雏鸡的免疫抑制状态,雏鸡孵出后再经呼吸道感染禽波氏菌,模拟临床二者的混合感染。分别监测混合感染与单纯感染条件下雏鸡的生长状况、免疫器官指数、NDV灭活苗免疫抗体水平、禽波氏菌抗体水平、禽波氏菌入侵组织时间、组织病理学变化以及其他细菌的继发感染状况等。结果发现REV感染可导致雏鸡严重的生长抑制和免疫抑制作用,感染禽波氏菌后使抑制作用加重,且干扰了针对禽波氏菌的抗体的产生。禽波氏菌在REV免疫抑制状态雏鸡肝、心和肾中的检出时间比单纯感染组提前了1d。混合感染组雏鸡气管黏膜完全脱落,肝、心等组织内细胞广泛性坏死,细菌继发感染病例数增多。REV免疫抑制状态下,机体防御体系被破坏,对禽波氏菌的免疫应答降低,为禽波氏菌在组织中的侵袭扩散提供了便利,使禽波氏菌对雏鸡的致病性增强。

鸡波氏杆菌病研究初报

我们从某县种鸡场死亡的鸡胚和雏鸡中分离到一株病原菌,经鉴定为鸡波氏杆菌。由波氏杆菌引起的鸡胚胎死亡,孵化率降低,雏鸡的急性、致死性传染病,在国内外未见专门报道(国外只见到火鸡的波氏杆菌病报道)。现将该菌的分离、鉴定、免疫血情和诊断抗原的制备情况介绍如下:1 发病情况1.1流行病学及症状该种鸡场饲养的种鸡基本上无异常现象,个别出现拉绿便、腿麻痹、眼流泪、冠苍白或发紫;有的有神经症状。

禽波氏杆菌病病原性的研究

从患眼炎、鼻窦炎的不同地点、不同时间、不同发病鸡群的病料共分离到１７株细菌，经形态学、培养特性、生化试验和动物回归试验等结果表明，该细菌能运动、无芽孢的革兰氏阴性小杆菌，即禽波氏杆菌。该菌在鲜血平板上产生β溶血，在麦康凯平板上生长良好，形成光滑中央突起的珍珠状菌落。不利用糖类，不能在６．５％ＮａＣｌ培养基中生长，尿素酶和硝酸盐还原试验均呈阳性，能凝集豚鼠和其他动物红血球。人工接种细菌均能使雏鸡发生相似于自然病例的临床症状和死亡，并且从病变部位回收到相应细菌。

禽波氏杆菌病原性研究及防治初探

本文介绍了禽波氏杆菌的培养特性、药物敏感性及生化特性 ,重点进行了禽波氏杆菌对雏鸡的致病性研究 ,结果证明本菌主要引起雏鸡的急性死亡 ,主要病变为肺脏出血 ,肝脏出血、边缘坏死 ,肾脏出血 ,腺胃、肌胃浆膜出血 ,肠道出血。不同日龄的雏鸡对禽波氏杆菌的抵抗力不同 ,与日龄成正相关。同时还用不同来源的 8株禽波氏杆菌制成蜂胶灭活苗 ,并分别免疫 1日龄和 11日龄雏鸡 。

我国部分地区禽波氏杆菌病的血清学调查

对广西、河南、山东3省份17个鸡场的746份血清样品进行了禽波氏杆菌(Bordetellaavium)病的血清学调查。结果表明,该病在我国部分地区普遍存在,70日龄以下商品代和父母代肉鸡血清样品的禽波氏杆菌抗体阳性率较低(平均5.96%);70日龄以上肉种鸡血清样品的阳性检出率较高(平均50.00%),其中广西鸡场的阳性检出率为26.32%(65/247),河南鸡场的阳性检出率为76.76%(109/142),山东鸡场的阳性检出率为87.27%(48/55)。回归分析表明,禽波氏杆菌抗体阳性率与日龄呈显著正相关(r=0.928)。

禽波氏杆菌山东地区不同分离株的致病性研究

为检测禽波氏杆菌鸡胚分离株和呼吸道分离株对雏鸡的致病性差异,本研究对2004年~2011年分离鉴定的12株禽波氏杆菌进行了鸡胚半数致死量和雏鸡半数致死量的检测,筛选强毒菌株进行雏鸡的鼻腔感染试验。结果表明LL、XT和AQ分离株的毒力最强,其它分离株的毒力稍弱。3株强毒菌株均可感染雏鸡呼吸道和肺脏,引起呼吸道症状以XT和AQ的症状最为明显,而在其它内脏中造成感染的鸡只比例以LL株最高,可达30%~40%;AQ最低,仅10%。HE染色结果显示对气管的损伤以XT最强,而肺脏、肝脏等内脏器官的病理变化以LL最严重。免疫酶组化试验也证实LL在内脏组织中的载量要多于XT和AQ。3株菌株均可导致雏鸡的生长抑制和免疫器官损伤,对新城疫灭活苗免疫后的抗体水平具有轻微的抑制作用,且均以LL的抑制作用最强。实验结果显示在所检测的12株禽波氏杆菌中,鸡胚分离株LL毒力最强,具有比呼吸道分离株XT和AQ更强的感染雏鸡内脏组织的能力,本研究为进一步鉴定禽波氏杆菌毒力因子和免疫原性奠定了基础。

鸡波氏杆菌的毒力试验

本文介绍了鸡波氏杆菌对鸡胚、雏鸡、小白鼠、幼兔的毒力试验.结果表明,鸡波氏杆菌可致鸡胚、雏鸡、幼兔、小白鼠发病。病程为急性经过,呈出血性败血症病变。从病程和病变可看出,鸡胚、幼雏、家兔的日龄与抵抗力成正相关,1月龄以上的鸡有较强抵抗力,呈隐性带菌。通过成年兔,豚鼠的汞氏皮内反应表明鸡波氏杆菌可产生毒性很强的坏死毒素。

鸡组织中禽波氏杆菌间接免疫荧光组化定位检测方法的建立

为研究禽波氏杆菌感染鸡后在体内组织器官中的定植规律及其在不同组织细胞中的定位、定量状况,本试验对禽波氏杆菌感染鸡组织器官的固定剂进行了筛选,制备石蜡切片,选择良好的粘片剂,利用纯化的兔抗禽波氏杆菌外膜蛋白IgG作为一抗,建立了能进行禽波氏杆菌抗原定位检测的间接免疫荧光组化法,并对禽波氏杆菌人工感染鸡进行了检测。经多次优化,确定将10%中性福尔马林作为固定剂固定组织24h,0.1%多聚-L-赖氨酸作为切片的粘片剂。最佳工作条件为2%脱脂奶粉37℃封闭30min;兔抗禽波氏杆菌外膜蛋白IgG 1∶100稀释,4℃孵育过夜;荧光素标记羊抗兔二抗1∶20稀释,37℃作用30min。该方法重复性和特异性检测良好,对禽波氏杆菌感染雏鸡组织器官的检测结果表明,该法能特异性地对鸡组织器官中的禽波氏杆菌进行抗原定位,气管、肺脏、肝脏、心脏、脾脏、肾脏中的禽波氏杆菌抗原均呈现特异性荧光信号,同细菌分离鉴定方法检测的阳性符合率为99.27%。试验结果表明,本试验所建立的间接免疫荧光组化法可作为一种有效的检测方法用于禽波氏杆菌致病机制的研究。

三种常见鸡胚胎性疫病病原人工共感染的试验检测

近几年,家禽发生多种病原共感染的现象非常普遍,多种病原共感染常常引起非典型的病变,并进而导致重大的经济损失。细菌性胚胎性疫病病原种类较多,且大多是条件性致病菌,由不同的细菌多重感染诱发的疾病越来越常见,鸡毒性支原体(Mycoplasma gallisepricum,MG)、鸡沙门氏菌(Salmonella Avium)、禽波氏杆菌(Bordetella Avium)为三种常见鸡胚胎细菌性疫病的病原。因此,本研究针对这三种常见鸡胚胎细菌性疫病的病原进行了共感染的分析与检测。目的在于研究这三种微生物的共感染的发病情况、病理变化、病原微生物的分布及其消长规律,以及与单独感染的差别。通过本研究为鸡场中此类疾病提供理论依据。方法:分别对1日龄SPF雏鸡(10只/组)和11日龄SPF鸡胚(10枚/组)进行3种病原、2种病原、1种病原的感染。随时进行生长情况的观察,对死亡雏鸡、鸡胚进行剖检。结果,无论通过肉眼观察和还是病理学观察,3种病原共感染的雏鸡和鸡胚病变最严重,出现死亡时间最早,并且死亡率最高,两种病原共感染次之,但是多种病原共感染情况都比一种病原单独感染严重。为了进一步研究发生共感染之后,病原的分布及其随时间的消长规律,分别对剖检雏鸡与鸡胚取样,进行IFA与PCR的检测,结果表明,支原体的侵袭,气囊感染最严重,肾脏次之,其后是肝脏。波氏杆菌与沙门氏菌在肝脏和法氏囊感染最严重,肾脏和肺脏次之,另外,对于波氏杆菌感染鸡,从皮下也有大量病原菌存在。雏鸡在感染24 h内各病原含量呈快速增长趋势,36 h之后达到高峰,然后下降,在三种病原共感染的雏鸡的组织中,每种病原的含量与单独感染、双重感染的含量相差不大。鸡胚在感染24 h内各病原含量呈增长趋势,24 h之后下降,多种病原共感染的鸡胚分离得到的单独一种病原的含量略低于单独感染的鸡胚。本研究通过较为系统的分析与检测,为进一步认识与防治多重感染在禽类胚胎细菌性疫病的发生提供了依据,对控制多种微生物引起的胚胎细菌性疫病所造成的经济损失具有一定意义。

鸡胚中禽波氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

从出现孵化率降低(80.3%)和弱雏率增多(16.5%)等现象的山东某大型海蓝褐种禽孵化场18日龄将出壳鸡胚中分离到1株禽波氏杆菌,命名为LL09株,并进行了23S rRNA的序列扩增和耐药性分析。结果表明,其23S rRNA序列与同年分离到的XT09株的同源性为100%,与其它8株B.avium的同源性为96.2%～96.6%,而与GenBank中收录的B.avium NC-010645的同源性为95.8%。该菌对所检测的14类47种药物中有28种呈现完全耐药,6种为低敏,只有13种药物比较敏感。耐受药物中包括了头孢类、青霉素类、单酰胺环类、大环内酯类、糖肽类、磺胺类等常用药物,只有喹诺酮类、氨基糖苷类和呋喃类中的部分药物的杀菌效果较好。

禽波氏杆菌对雏鸡和鸡胚毒力的测定

本文介绍了禽波氏杆菌对雏鸡和鸡胚毒力的测定。测定结果表明,禽波氏杆菌对2日龄公雏腹腔接种的 LD_(50)为1.352×10~4个菌,对12日龄鸡胚尿囊腔内接种的 MLD 低于196个菌。

禽波氏菌强毒株感染雏鸡呼吸系统荷菌量及病变规律的研究

禽波氏菌为产碱杆菌科波氏杆菌属成员,主要导致咳嗽等呼吸道症状。为探索禽波氏菌经呼吸道的入侵过程及其病变发生发展规律,本试验利用筛选到的强毒株经鼻腔感染SPF雏鸡,在感染后的不同时间检测气管和肺荷菌量的变化,通过扫描电镜观察禽波氏菌在气管的定植及其病变规律,利用间接免疫酶组化研究禽波氏菌在肺中的定植规律,分析肺和支气管的病理组织学变化。结果发现,在感染之初气管中细菌数量较多,而肺中较少,之后气管和肺的荷菌量均呈明显上升趋势。感染后1d即发现禽波氏菌已经在气管纤毛上定植,且纤毛开始出现脱落;到5d时气管黏膜表面呈斑驳状,纤毛大面积脱落,甚至出现空洞。肺在感染后2d检测出细菌定植,主要分布在肺房和呼吸毛细管壁的细胞质中,之后随着感染时间的延长,阳性信号不断增加。肺和支气管的病理变化在5d时出现,主要表现淤血;至感染后10d,大量细胞坏死。试验结果表明所筛选禽波氏菌分离株对雏鸡的呼吸道具有很强的亲嗜性,优先定植于气管上皮细胞的纤毛上,并随之在气管、支气管和肺产生一系列的组织病理学变化。

禽波氏杆菌RAPD-PCR反应体系的建立与优化

随机扩增多态性DNA(RAPD)作为一种分子标记技术,可用于多种病原菌的基因分型。为建立适合禽波氏杆菌RAPD分析的扩增体系,本试验以禽波氏杆菌基因组DNA为模板,对20条随机引物进行了筛选,并对RAPD-PCR反应体系中的重要参数设置梯度进行单因素试验分析,以确定最佳反应条件。经大量重复试验筛选到6条随机引物,确定25μL的反应体系中模板DNA的量为50ng,随机引物浓度为0.2μmol/L,dNTPs的量为0.2mmol/L,Mg^(2+)浓度为1 mmol/L,Taq酶为1U。该优化体系对22株禽波氏杆菌均能扩增出清晰稳定且多态性好的DNA指纹图谱,为后续的禽波氏杆菌RAPD基因分型奠定了良好的基础。

禽波氏杆菌HagA蛋白基因的序列分析及抗原表位预测

试验旨在对禽波氏杆菌的血凝素HagA蛋白的二级结构与B细胞抗原优势表位进行预测,探讨以血凝素HagA蛋白制作单克隆抗体的可能性。首先对禽波氏杆菌的血凝素hagA基因进行了PCR扩增以及序列测定,利用生物信息学的相关软件与分析方法,对血凝素HagA蛋白的二级结构以及B细胞抗原表位进行分析预测。经综合分析表明,禽波氏杆菌的HagA蛋白氨基酸序列中存在7个B细胞优势抗原表位区域,6个可能的糖基化位点。研究结果为进一步分析禽波氏杆菌HagA蛋白的生物学功能、制备单抗和研制疫苗等奠定了基础。