自建Lowry法测定B型肉毒神经毒素蛋白质含量

目的:探究适宜的B型肉毒神经毒素中蛋白质含量测定方法。方法:分别应用《中国药典》四部(2020版)中蛋白质测定法项下福林酚法(药典方法)和自建的Lowry法(本方法)测定3批B型肉毒神经毒素中的蛋白质含量,比较两种方法的线性关系、精密度和准确度。结果:两种方法的线性都具有良好的相关性,药典方法和本方法线性绝对系数R2分别为0.9972和0.9987;两种方法都具有良好的精密度和重复性,但本方法的相对标准偏差更低。结论:自建的Lowry法更适合B型肉毒神经毒素中蛋白质含量的测定。

鼠源抗B型肉毒毒素单链抗体噬菌体文库的构建筛选及抗体免疫学活性的初步研究

B型肉毒毒素重链C-端片段(BoNTB/Hc)经金属螯和层析法纯化后免疫Balb/c小鼠,从其脾淋巴细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,用抗体可变区混合引物进行全套抗体重、轻链可变区基因的扩增,体外随机装配成单链抗体(scFv)。将其克隆至pCANTAB5E中,构建单链抗体噬菌体抗体库。结果表明经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的富集过程,筛选获得高亲和力的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。

B型肉毒毒素单克隆抗体杂交瘤株的建立

[目的]制备、筛选稳定分泌B型肉毒毒素单抗的杂交瘤克隆,为相关研究提供工具。[方法]采用纯化的B型肉毒毒素免疫BALB/c小鼠,用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选阳性克隆。[结果]得到10株稳定分泌B型肉毒毒素单抗的杂交瘤克隆,1株为IgM,其余9株分泌IgG,亚类为IgG2a。10株单克隆抗体均与B型肉毒毒素呈特异性反应,而与标准A型肉毒毒素无交叉反应,腹水单抗的效价均在105以上。[结论]10株杂交瘤细胞株均能分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体,为B型肉毒毒素的检测和研究提供了工具。

鼠源抗B型肉毒毒素Fab抗体库的构建及初步筛选

目的:应用重组噬菌体抗体库技术制备抗B型肉毒毒素Fab抗体。方法:用重组B型肉毒毒素重链C端片段(BoNTB/Hc)免疫BALB/c小鼠,从其脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白Fd段和κ链基因,克隆至表达载体pComb3中,并将抗体Fab段表达于噬菌体表面,建立容量为5.96×106cfu的噬菌体抗体库。以BoNTB/Hc为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,获得与B型肉毒毒素特异性结合的克隆,并进行序列测定。结果:构建了抗B型肉毒毒素Fab抗体库,筛选出特异性克隆1个。结论:从鼠源噬菌体免疫抗体库中初步获得了特异性抗B型肉毒毒素的Fab抗体。