Expression and Antigenic Characterization of the Epitope-G_1 of the Bovine Ephemeral Fever Virus Glycoprotein in Pichia pastoris

The epitope-G1 gene of Bovine ephemeral fever virus(BEFV) glycoprotein was synthesised by PCR and cloned into expression vector pPIC9K to construct recombinant plasmid pPIC9K-G1.Then the pPIC9K-G1 was linearized and transformed into Pichia pastoris GS115.The recombinant P.pastoris strains were selected by a G418 transformation screen and confirmed by PCR.After being induced with methanol,an expressed protein with 26 kDa molecular weight was obtained,which was much bigger than the predicted size(15.54 kDa).Deglycosylation analysis indicated the recombinant G1 was glycosylated.Western blot and ELISA tests,as well as rabbit immunization and specificity experiments indicated that the target protein had both higher reaction activity and higher immunocompetence and specificity.The recombinant G1 protein could be used as a coating antigen to develop an ELISA kit for bovine ephemeral fever diagnosis.

牛流行热病毒灭活疫苗免疫后牛外周血淋巴细胞亚类分布的研究

对牛流行热病毒灭活疫苗免疫并攻毒后 ,牛外周血淋巴细胞亚类的变化进行了研究。结果表明 ,灭活苗免疫后 ,牛的CD4 + 显著升高 ,可能与参与辅助B淋巴细胞合成抗体有关 ,攻毒后 ,γδT细胞均显著上升 ,免疫组在攻毒后 3周仍保持在相当的高水平 ,IL_2Rα阳性细胞在攻毒后高热期也有显著升高 ,而CD8+ 细胞没有明显变化。

牛流行热病毒JB76H株G蛋白基因核苷酸序列分析

通过反转录_聚合酶链反应(RT_PCR),从中国北京分离株牛流行热病毒JB76H 基因组RNA中扩增出主要保护性抗原糖蛋白G的cDNA。采用Sanger’s 双脱氧末端终止法测定cDNA 片段的核苷酸序列,并推导出氨基酸序列。G基因全长为1872 个碱基,单一的开放阅读框架编码623 个氨基酸的多肽。将测得的序列与澳大利亚六个分离株进行比较,发现我国分离株与澳大利亚分离株间同源性为91% ,低于澳大利亚各分离株之间的同源性(98% ～99% ) 。同时氨基酸序列比较结果也显示,我国分离株与澳大利亚分离株间同源性(93.9% )低于澳大利亚各分离株之间的同源性(96% ～98 %) 。

表达牛流行热病毒G基因的牛传染性鼻气管炎病毒转移载体的构建

本试验将克隆到 p BLG中的牛流行热病毒 (BEFV)糖蛋白 G基因亚克隆到含有 CMV启动子和 Poly(A)信号尾的 p CR3- Uni载体上 ,获得 p CR3- G重组体 ,酶切后将含有 CMV、G基因和 Poly(A)的目的片段 (约 3.6 kb)插入通用转移载体 pd TK- CMB中 ,获得 pd TK- CMB- G重组体 ;再将含 SV4 0启动子的 L ac Z报告基因也亚克隆到该载体中获得表达 BEFV G基因的pd TK- L ac Z- G转移载体 ,为开发

表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建

病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点 ,是当今最有发展前景的疫苗研究领域之一。试验将已构建的表达牛流行热病毒 (BEFV)结构糖蛋白 G基因的牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV )转移载体 pd TK - L ac Z-G,通过脂质体方法转染由牛传染性鼻气管炎病毒 Bartha毒株感染的 MDBK细胞 ,筛选出形成蓝色蚀斑的重组病毒 ,并对其进行蚀斑纯化。通过 PCR方法鉴定该重组病毒证明基因组中含有完整的牛流行热病毒 G蛋白基因 ,实验为开发 BEFV/ IBRV二联基因工程疫苗奠定了基础。

牛流行热病毒糖蛋白基因的原核表达与抗原性鉴定

为探索可用来开发牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus,BEFV）疫苗和诊断试剂的候选基因,本研究针对BEFV糖蛋白（G）基因设计了2对特异性引物,用PCR方法扩增基因片段,PCR产物经XhoⅠ和NdeⅠ双酶切后亚克隆到表达载体pET-30上,将鉴定正确的重组质粒（480-pET-30、1107-pET-30）转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,培养阳性菌株D600nm值为0.6-1.0,37℃下用1.0mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,将其纯化之后进行SDS-PAGE和Western blotting免疫原性分析。同时,应用间接ELISA、动物免疫试验及交叉反应试验对目的蛋白进行分析。结果表明,首次发现的1 107bp基因片段是分段表达的,具有很好的生物活性和特异性,更适合作为开发疫苗和诊断试剂的候选基因,为今后建立BEFV的血清学诊断方法及疫苗研发提供了理论基础。