Expression and Antigenic Characterization of the Epitope-G_1 of the Bovine Ephemeral Fever Virus Glycoprotein in Pichia pastoris

The epitope-G1 gene of Bovine ephemeral fever virus(BEFV) glycoprotein was synthesised by PCR and cloned into expression vector pPIC9K to construct recombinant plasmid pPIC9K-G1.Then the pPIC9K-G1 was linearized and transformed into Pichia pastoris GS115.The recombinant P.pastoris strains were selected by a G418 transformation screen and confirmed by PCR.After being induced with methanol,an expressed protein with 26 kDa molecular weight was obtained,which was much bigger than the predicted size(15.54 kDa).Deglycosylation analysis indicated the recombinant G1 was glycosylated.Western blot and ELISA tests,as well as rabbit immunization and specificity experiments indicated that the target protein had both higher reaction activity and higher immunocompetence and specificity.The recombinant G1 protein could be used as a coating antigen to develop an ELISA kit for bovine ephemeral fever diagnosis.

基于G_(NS)蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断ELISA方法的建立

旨在建立牛流行热病毒(BEFV)感染与疫苗免疫的抗体ELISA诊断方法。在证实BEFV G_(NS)截短体与BEFV感染血清特异性反应的基础上,利用原核表达系统表达纯化G_(NS)全长蛋白并以其作为包被抗原,优化反应条件,建立基于BEFV G_(NS)的鉴别病毒感染与疫苗免疫的BEFV间接ELISA方法。结果显示:在大肠杆菌中成功表达G_(NS)蛋白,主要以包涵体的形式存在,纯化获得73 ku的重组蛋白。Western blot结果显示,纯化后的重组蛋白与BEFV感染牛血清反应原性良好,且与BEF疫苗免疫牛血清未见反应。G_(NS)抗原最佳包被浓度为0.50μg·mL^(-1),血清最佳稀释度为1∶20,酶标二抗最佳稀释度为1∶4000,阴阳性临界值为S/P值0.2069。该方法与BVDV、FMDV以及IBRV阳性血清无交叉反应,特异性良好;批内和批间变异系数均小于10%,重复性良好,可用于BEFV感染与疫苗免疫牛的鉴别诊断。

牛流行热检测方法及疫苗研究现状

牛流行热(BEF)是由牛流行热病毒(BEFV)引起的一种急性、热性、非接触性疾病。BEF发病率高,在世界范围内流行,严重阻碍了各国养牛业的快速发展。迄今为止尚无针对BEF的有效治疗方法,检测和疫苗接种成为防控该病的关键环节。文章对近年来国内外在BEF血清学、分子生物学诊断方法以及灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗等方面的研究成果进行综述,并对不同检测方法和疫苗进行比较,旨在为快速诊断和有效防控BEF提供参考。

广东省牛流行热病毒分离株JM 2020的全基因组测序及进化分析

[目的]分析广东省牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus,BEFV)分离株JM 2020与其他地区毒株的进化关系,阐明遗传进化与全基因组的特征,为中国乃至世界对牛流行热疾病的流行情况以及预防该疾病提供有用信息。[方法]根据从GenBank下载的BEFV毒株的全基因组序列信息,设计引物PCR扩增糖蛋白(Glycoprotein,G)基因;另设计10对引物用于扩增全基因组,送测序得到10个片段的基因序列,运用DNAStar软件中的EditSeq手动编辑和拼接获得全基因组序列。运用MEGA 6.0分别构建G基因和全基因组进化树进行进化分析。[结果]JM 2020毒株的G基因和全基因组与泰国毒株的核苷酸序列相似性均最高,分别为94.9%~99.3%和99.0%,进化分析表明JM 2020与2013—2017年泰国毒株处于同一小分支,而与JB76H、JT02L等国内毒株有一定进化距离。全基因组测序结果表明,JM 2020全基因组长度为14 902个核苷酸(nt),包括50 nt的前导序列,1 296 nt的核蛋白(Nucleoprotein,N)基因,837 nt的磷蛋白(Phosphoprotein,P)基因,672nt的基质蛋白(Matrixprotein,M)基因,1 872 nt的G基因,1 812 nt的非结构糖蛋白II (Non-structural glycoprotein II,GNS)基因,618 nt的α1、α2基因,444 nt的β基因,345 nt的γ基因,444 nt的RNA依赖性聚合酶(Large multi-functional enzyme,L)基因和73 nt的尾随序列,且分别被21、47、68、67、23、64、59、79和35nt的区域隔开。JM 2020、qy2017及泰国毒株均出现P′基因(P基因多顺反子产物)截断的特征。[结论]JM2020毒株与2017年分离毒株qy2017序列相似性高且均与泰国毒株进化关系较近,与JB76H等我国其他地区毒株有一定进化距离。该研究丰富了中国BEFV流行株的基因组信息,为牛流行热疫病综合防控及开发新疫苗奠定了基础。

牛流行热病毒可视化RT-LAMP检测技术的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、简便、可视化地检测牛流行热病毒的分子生物学方法。【方法】根据牛流行热病毒G蛋白基因的6个保守区域设计2对引物,建立牛流行热病毒可视化逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测技术,优化RT-LAMP的反应条件,将其与PCR方法进行比较。【结果】当Mg2+浓度为3 mmol·L^(-1)、甜菜碱浓度为0.4 mol·L^(-1)、d NTPs mix浓度为1.2μmol·L^(-1)、内外引物浓度比例为8∶1、反应温度为63℃时,反应梯形条带最明显,在反应40 min后可以观察到明显的梯形条带。建立的RT-LAMP检测方法特异性好,只对牛流行热病毒进行扩增;灵敏度比普通PCR高10倍。【结论】该方法操作简便,特异性强,结果判读方便,可用于牛流行热的快速检测。

牛流行热病毒灭活疫苗免疫后牛外周血淋巴细胞亚类分布的研究

对牛流行热病毒灭活疫苗免疫并攻毒后 ,牛外周血淋巴细胞亚类的变化进行了研究。结果表明 ,灭活苗免疫后 ,牛的CD4 + 显著升高 ,可能与参与辅助B淋巴细胞合成抗体有关 ,攻毒后 ,γδT细胞均显著上升 ,免疫组在攻毒后 3周仍保持在相当的高水平 ,IL_2Rα阳性细胞在攻毒后高热期也有显著升高 ,而CD8+ 细胞没有明显变化。

牛流行热病毒山东地方株的分离与鉴定

利用BHK-21细胞,接种山东济南地区疑似牛流行热病牛高热期的抗凝血,经盲传3代,分离到1株病毒,经RT-PCR鉴定为牛流行热病毒,命名为BEFV-SD。理化特性试验表明:BEFV-SD对热敏感,56℃10 min、37℃18 h可被灭活,对乙醚、氯仿等敏感;BEFV-SD可被BEFV阳性血清中和,中和效价为1∶408;将BEFV-SD的G基因与GenBank中公布的BEFV进行同源性比较,同源性达到96.3%以上。

表达牛流行热病毒G基因的牛传染性鼻气管炎病毒转移载体的构建

本试验将克隆到 p BLG中的牛流行热病毒 (BEFV)糖蛋白 G基因亚克隆到含有 CMV启动子和 Poly(A)信号尾的 p CR3- Uni载体上 ,获得 p CR3- G重组体 ,酶切后将含有 CMV、G基因和 Poly(A)的目的片段 (约 3.6 kb)插入通用转移载体 pd TK- CMB中 ,获得 pd TK- CMB- G重组体 ;再将含 SV4 0启动子的 L ac Z报告基因也亚克隆到该载体中获得表达 BEFV G基因的pd TK- L ac Z- G转移载体 ,为开发

牛流行热病毒糖蛋白G_1抗原表位在毕赤酵母中的表达和抗原性鉴定

从包含牛流行热病毒G蛋白基因的质粒pMD-G中克隆G1抗原表位区基因,亚克隆进表达载体pPIC9K,构建重组载体pPIC9K-G1,线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418压力和PCR法筛选阳性重组酵母进行诱导表达。经SDS-PAGE、脱糖基化分析、Western blot、ELISA、兔体免疫实验和特异性分析,表明该基因在GS115中表达并进行了适度的糖基化,表达蛋白有良好的生物学活性和特异性,可作为包被抗原,开发ELISA诊断试剂盒。

牛流行热病毒分离株HN1/2012的全基因组序列测定及演化分析

旨在解析我国牛流行热病毒(BEFV)分离株HN1/2012的基因组特征,为阐明我国BEFV毒株的演化规律提供数据。根据GenBank中收录的BEFV毒株的全基因组信息,设计引物,以RT-PCR扩增11段相互部分重叠的DNA片段,克隆至pGEM T-easy载体,分别进行测序,利用DNAStar软件进行序列拼接获得HN1/2012株的全基因组序列。根据BEFV编码基因的转录起始(TI)和转录终止/多聚腺苷酸化(TTP)序列分析获得各基因序列及其开放阅读框(ORF),与参考毒株比对序列相似性,并以G基因序列构建系统发生树,分析其遗传演化关系。结果显示:HN1/2012株基因组全长为14 899nt,包含前导序列(50nt)、N基因(1 328nt)、P基因(858nt)、M基因(691nt)、G基因(1 896nt)、GNS基因(1 785nt)、α1α2基因(638nt)、β基因(459nt)、γ基因(400nt)、L基因(6 470nt)和尾随序列(70nt)。病毒9个基因分别由26、43、47、53、37、39、30、-21nt的基因间隔区(IGR)连接。在全基因组水平,HN1/2012株与我国2002年浙江分离株JT02L的相似性最高,但G基因与同期分离株LYC11、LS11相似性最高。重组分析表明HN1/2012株未发生基因重组。HN1/2012株的演化可能与免疫选择压力导致的基因突变有关。本研究测定了HN1/2012株的基因组序列,为我国BEFV分离株的全基因组分子演化研究奠定了基础。

表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建

病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点 ,是当今最有发展前景的疫苗研究领域之一。试验将已构建的表达牛流行热病毒 (BEFV)结构糖蛋白 G基因的牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV )转移载体 pd TK - L ac Z-G,通过脂质体方法转染由牛传染性鼻气管炎病毒 Bartha毒株感染的 MDBK细胞 ,筛选出形成蓝色蚀斑的重组病毒 ,并对其进行蚀斑纯化。通过 PCR方法鉴定该重组病毒证明基因组中含有完整的牛流行热病毒 G蛋白基因 ,实验为开发 BEFV/ IBRV二联基因工程疫苗奠定了基础。

牛流行热病毒G_1抗原表位基因在大肠杆菌中的表达、纯化及抗原性鉴定

从包含牛流行热病毒G蛋白基因的质粒pMD-G中克隆G1抗原表位区基因,与表达载体pGEX-4T-1连接,成功构建重组质粒pGEX-G1。重组质粒转化BL21(DE3),以IPTG进行诱导,并确定了最佳表达条件的IPTG浓度为0.1mmol/L、反应温度为16℃、诱导时间为18h。可溶性表达的目的蛋白经Glutathione Sepharose TM4B介质纯化,纯度达80%;以包涵体形式存在的重组蛋白以2%的脱氧胆酸钠洗涤、0.5%的N-十二烷基肌氨酸钠溶解、透析复性、Glutathione Sepharose TM4B纯化后,纯度达85%以上。Western blot试验表明纯化的目的蛋白有良好的反应原性。经间接ELISA检测,测得牛流行热病毒12份阳性血清的OD490值平均为1.813±0.231,12份阴性血清的OD490值平均为0.359±0.032,差异极显著(P<0.01)。将重组蛋白作为抗原免疫兔子,试验兔均产生了高滴度的抗体,证实该蛋白有免疫原性。将目的蛋白作为包被抗原,测得8份狂犬病病毒阳性血清的OD490值平均为0.324±0.031,与所测12份阴性血清的OD490值接近,说明不存在交叉反应。以上结果均证实纯化后的重组蛋白有良好的生物学活性和特异性,可作为包被抗原,开发ELISA试剂盒。

牛流行热病毒山东流行株G基因的克隆及序列分析

为了解牛流行热病毒(BEFV)山东流行株G基因的特点,从临床病料中获得山东流行株牛流行热病毒的G基因,并对其进行序列测定和分析。参考GenBank中牛流行热病毒的G基因序列,设计并合成一对特异性扩增G基因引物进行PCR,扩增目的片段,并克隆于pEASY-T3载体上,筛选阳性重组质粒进行序列测定,用MEGA软件、NJ法构建进化树。结果显示,该流行毒株G基因与GenBank中其他BEFV株G基因的核苷酸推导氨基酸的同源性均大于96%;遗传进化关系分析结果表明,BEFV山东流行株与中国台湾流行株具有较高同源性和较近的亲缘关系。

牛流行热病毒糖蛋白基因的原核表达与抗原性鉴定

为探索可用来开发牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus,BEFV）疫苗和诊断试剂的候选基因,本研究针对BEFV糖蛋白（G）基因设计了2对特异性引物,用PCR方法扩增基因片段,PCR产物经XhoⅠ和NdeⅠ双酶切后亚克隆到表达载体pET-30上,将鉴定正确的重组质粒（480-pET-30、1107-pET-30）转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,培养阳性菌株D600nm值为0.6-1.0,37℃下用1.0mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,将其纯化之后进行SDS-PAGE和Western blotting免疫原性分析。同时,应用间接ELISA、动物免疫试验及交叉反应试验对目的蛋白进行分析。结果表明,首次发现的1 107bp基因片段是分段表达的,具有很好的生物活性和特异性,更适合作为开发疫苗和诊断试剂的候选基因,为今后建立BEFV的血清学诊断方法及疫苗研发提供了理论基础。

牛暂时热研究进展

牛暂时热是一种发生于热带与温带地区牛的急性、免疫病理性病毒病 ,包括蚊、蠓在内的多种昆虫参与了该病的传播。本文就 BEFV的病原学、流行病学、传播、防制。

徐州地区牛流行热病毒的分离与鉴定

1991年夏秋之交徐州市各奶牛场暴发牛流行热。为确诊该病,采集了发病高热期抗凝血,进行了病毒分离和鉴定试验。病料经处理后,直接接种于BHK_21细胞,传至第二代可见典型的CPE。电镜下观察到80—150nm弹状病毒颗粒。分离毒的理化特性、核酸类型及中和试验结果均与标准BEFV相一致,证实该分离病毒为牛流行热病毒。

一株牛流行热病毒的分离与鉴定

牛流行热病毒(BFFV)是引发世界范围内牛流行热最主要病原之一,给奶牛业的发展造成严重危害。本研究通过RT-PCR对疑似牛流行热奶牛抗凝血样品进行检测,选取阳性样品颅内接种3日龄乳鼠,7日后乳鼠死亡,鼠脑组织通过PCR扩增出BFFV目的条带,乳鼠颅内重复接种3次,乳鼠发病死亡时间明显提前。选取阳性脑组织接种BHK-21细胞,盲传3代后出现明显细胞病变,特异性引物扩增获得目的条带,测序结果与牛流行热病毒序列一致,表明成功分离到一株牛流行热病毒。

牛流行热病毒山东分离株α3基因序列分析及原核表达与纯化

为深入研究牛流行热病毒(BEFV)编码的α3非结构蛋白的功能及其在研发新型BEFV疫苗和诊断试剂上的应用,本研究对本实验室分离保存的BEFV采用RT-PCR法对其α3基因进行扩增;用DNAStar软件对序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析;用ProtParam和抗原表位分析生物信息学软件研究α3蛋白的亲水性、优势抗原表位区;分别用限制性内切酶双酶切目的基因α3和pGEX-4T-1载体,构建pGEX-4T-1-α3原核表达载体,并进行诱导表达。结果表明,成功扩增出156bp的α3基因序列;该α3基因序列与参考毒株的核苷酸序列同源性为98.0%~100.0%,氨基酸序列的同源性也为98.0%~100.0%,表明α3蛋白具有较高的保守性;BEFV的α3蛋白抗原表位分析表明3~5、9~47aa是α3蛋白的优势抗原表位区段,总平均疏水性为-0.737,说明该蛋白以可溶性形式存在;构建的pGEX-4T-1-α3原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达,应用可溶性蛋白纯化的方法获得较高纯度的α3蛋白。本研究为该蛋白的免疫原性验证以及新型牛流行热病毒疫苗研发提供了数据参考。

牛流行热病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛流行热病毒(BEFV)的荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的BEFV的G基因保守序列设计了1对特异性引物。结果显示,建立的标准曲线线性关系较好,其相关系数为0.996 3。该方法仅对BEFV检测为阳性,表明其特异性强。该方法的检测下限约为4.0×10^1 copies/μL,比普通PCR敏感性高10倍。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于0.76%。利用本方法分别对45份牛病料样品进行检测,结果检出了11份阳性样品,表明所建立的荧光定量PCR方法准确可靠,可以用于BEFV的快速诊断和定量分析。

表达牛流行热病毒G蛋白的重组狂犬病病毒的构建及鉴定

目的以狂犬病病毒(RABV)弱毒株SAD株为载体,构建表达牛流行热病毒(BEFV)G蛋白的重组病毒SAD-BG。方法利用反向遗传技术将BEFV的G蛋白基因ORF插入到SAD株基因组的伪基因区,获得感染性克隆,与辅助质粒共转染BHK-21细胞,获得重组病毒SAD-BG株。结果与结论通过RT-PCR、免疫荧光染色鉴定,表明BEFV G蛋白基因存在于重组病毒基因组,且能表达自身RABV G蛋白与外源BEFV G蛋白。通过BHK-21细胞和NA细胞鉴定重组病毒的生长特性,在NA细胞中重组病毒的滴度高于亲本SAD株,可达1.3×108FFU/ml。成功构建了表达BEFV G蛋白的重组病毒SAD-BG,为进一步研制预防狂犬病和牛流行热(BEF)的二联疫苗奠定了基础。