Isolation and Culture of Fetal Fibroblasts of Tibetan Yellow Cattle

[ Objective] To isolate fetal fibroblasts from Tibetan yellow cattle and thus to provide the ideal biological material for cloning and cellular biology of animals inhabiting in the Tibet Plateau. [ Method] The fibroblast cells were isolated from tissues of Tibetan yellow fetus by explant culture method. The subculture, morphology and dynamics were observed. [ Result] The fetal fibroblasts of Tibetan yellow cattle had typical morphology of fibroblast calls. The isolated cells had three growth stages including retention period （0 -2 d）, logarithmic phase （2 -7 d） and platform phase （7 -8 d）. Its doubling time was 60 h. [ Conclusion] Fetal fibroblasts of Tibetan yellow cattle have been successfully cultured.

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。

山羊胎儿成纤维细胞的冷冻保存和体外培养(英文)

将胎儿成纤维细胞悬浮于不同的冷冻保护液中 ,在不同的温度下进行冷冻保存试验。结果显示 ,当保护液中含有 90 0 m L / L胎牛血清 (FBS)时 ,- 196℃下保存的山羊胎儿成纤维细胞解冻后的细胞贴壁率高于- 80℃ ,且前者贴壁细胞增殖也较后者快 ,二者间差异显著 ;而在 - 2 0℃条件下只有一小部分细胞能够存活 ,与前两者相比差异极显著 ,说明 - 2 0℃不适合冷冻胎儿细胞。冷冻保护液中含有 10 0 m L / L二甲基亚砜 (DMSO)的保护效果明显好于 5 0 m L / L DMSO,二者间差异显著。用组织块法培养的细胞 ,在两种培养基 DMEM和 M199中添加 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 -巯基乙醇 (2 - Me) ,其组织块成活率及细胞生长速度均高于单纯添加 10 0 m L / LFBS,同时证明 DMEM和 M199都能用于胎儿成纤维细胞的体外培养。以 DMEM培养液为基础 ,分别添加 2mm ol/ L 2 - Me,5 m L / L FBS,10 0 m L / L FBS和 2 m mol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS对山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养 ,结果显示 ,细胞在 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS培养液中生长迅速 ,两者间无明显差异 ,2 - Me的存在促进了细胞的增殖 ;两者都与添加 2 m mol/ L 2 - Me组存在显著差异 ;添加 2 m mol/ L 2 - Me和 5m L / L

一种提高体外培养细胞中期分裂相的新方法

为了提高体外培养细胞中期分裂相,用黄牛胎儿成纤维细胞系(YFF)和西门塔尔小牛成纤维细胞系(CNF)为实验材料,先经4℃低温休克再用秋水仙素处理后制备染色体,比较了不同低温休克处理时间获得的中期分裂相百分率,并运用该方法对20代内YFF和CNF核型变异进行了分析。实验发现,YFF和CNF经低温休克中期分裂相百分率显著高于对照组(P<0.05)。其中,20h低温组中期分裂相(31.7%和40.2%)高于对照组(4.7%和6.4%)5倍以上(P<0.01)。实验结果表明,4℃低温休克法是一种提高体外培养细胞中期分裂相的简便方法,适于监测体外培养细胞核型变异。

体外培养枫径猪胚胎成纤维细胞系方法的建立

选取枫径猪胚胎,采用胶原酶消化培养法制备猪胚胎成纤维细胞,经数次传代培养及冷冻复苏试验表明胚胎成纤维细胞仍具有正常的传代能力。在体外培养至15代后成纤维细胞核型正常,符合体细胞克隆转基因的要求。用PCR方法建立了枫径猪胚胎成纤维细胞性别鉴定的反应体系,对其中6株细胞进行了性别鉴定。

培养方法及胎牛血清浓度对人胎儿成纤维细胞体外生长的影响

采用单细胞培养法和组织块培养法从原代培养人胎儿成纤维细胞,并在不同体积分数胎牛血清(FBS)(0%、4%、8%、10%、12%)的条件下观察人胎儿成纤维细胞培养的状况并采用台盼蓝染色法进行活细胞计数.结果表明,早期由组织块培养法原代培养获取的细胞形态要比单细胞培养法原代培养获取的细胞稍好些,且在细胞传代后极少出现无法贴壁的死细胞.FBS对hFFs生长影响比较明显.在实际应用中,在体积分数8%FBS下,采用组织块培养法进行人胎儿成纤维细胞体外培养,效果良好.

长大二元杂交猪胎儿成纤维细胞的生物学特性

【目的】研究长大二元杂交猪胎儿成纤维细胞的生物学特性。【方法】采用室温消化法从妊娠30d的长大二元杂母猪胚胎中分离胎儿成纤维细胞,利用MTT法检测第5、10、15、25、35、45、60、70代胎儿成纤维细胞的增殖能力,通过倒置显微镜观察不同代数的细胞形态,流式细胞仪分析细胞周期变化,DAPI染色观察细胞核染色质的形态以及衰老相关β-葡糖苷酶活性的染色测定等方法来判断细胞的衰老程度。【结果】①采用消化液室温消化法成功分离到猪胎儿成纤维细胞,细胞具有典型的成纤维细胞形态。②猪胎儿成纤维细胞于生长初期1～6d呈对数增长,此后进入平台期。【结论】随着细胞代数的增加,细胞的增殖能力虽有所下降,但仍然呈稳定的增长状态,各代次猪胎儿成纤维细胞生长良好。

牛成纤维细胞的分离与体外培养

研究了牛胎儿和成年牛皮肤组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征。通过组织块贴壁培养和分离单细胞接种培养均能获得原代牛皮肤细胞。用2.5 g/L胰蛋白酶+1mmol/L EDTA和5 g/L胶原酶I联合消化牛皮肤组织较2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化,得到更多的单个细胞,两者之间差异极显著(P<0.01),但其死细胞比率却有较大升高;2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化牛胎儿组织得到的单细胞数显著高于皮肤组织消化后得到的细胞数(P<0.01),死细胞比率也高于同种酶消化的皮肤组织。分离纯化的胎儿和皮肤成纤维细胞的生长曲线都正常且相似。2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA消化贴壁细胞后死细胞率明显高于用0.5g/L胰蛋白酶+0.53 mmol/L EDTA消化的细胞(P<0.05);培养24 h后细胞贴壁率前者要明显低于后者(P<0.05)。用0.5 g/L胰蛋白酶轻度消化混杂生长的成纤维细胞和上皮样细胞,经过反复贴壁传代2～3代,可得到较纯的成纤维细胞。

西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离与培养

[目的]以西藏黄牛胎牛为材料,建立西藏黄牛胎儿成纤维细胞系,为在西藏特殊生境条件下高原物种的动物克隆及其他细胞生物学研究提供理想的生物学材料。[方法]对西藏黄牛胎儿成纤维细胞的分离和培养进行了研究。利用组织块法成功分离培养西藏黄牛胎儿成纤维细胞,对细胞的传代培养、形态学和动力学进行观察与分析。[结果]所建立的西藏黄牛胎儿成纤维细胞系具有典型的成纤维细胞形态;西藏黄牛胎儿成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0-2 d、2-7 d、7-8 d,细胞群体倍增时期为60 h。[结论]成功培养了西藏黄牛胎儿成纤维细胞。

牛胎儿成纤维细胞分离与体外培养

本研究以 4 5d牛胎儿为材料 ,使用 0 .2 5 %胰酶 + 0 .0 4 %EDTA消化液 ,分离得到牛胎儿成纤维细胞 ,体外培养传代至第 2 8代。本实验描绘出牛胎儿成纤维细胞生长曲线 ,并发现α MEM是一种适合牛胎儿成纤维细胞生长的培养基。分离得到的牛胎儿成纤维细胞传至第 1 8代时核型仍然正常 ,冷冻。

牛体外受精卵与牛胎儿睾丸支持细胞体外共培养研究

【目的】研究牛胎儿睾丸支持细胞对牛早期胚胎的体外发育是否有促进作用。【方法】从屠宰场采集5-7月龄胎牛睾丸，经原代和传代培养制备牛胎儿睾丸支持细胞（sertoli cells，SCs）饲养层，对比原代和传代胎牛睾丸SCs与牛体外受精卵共培养时受精卵的发育情况；分别以4×10^4，2×10^4mL。两个密度接种传代胎牛睾丸SCs与牛受精卵体外共培养，并以培养液中无牛胎儿睾丸SCs饲养层为对照，研究体外牛胎儿睾丸支持细胞（sertoli cells，SCs）对牛受精卵体外发育的影响。【结果】与牛受精卵体外共培养时，接种密度为2×10^4mL^-1传代胎牛睾丸SCs饲养层共培养组的卵裂率（79．3％）高于原代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组（69．2％），但差异不显著（P〉0．05）；囊胚发育率（41．3％）极显著地高于原代SCs饲养层共培养组（16．7％）（P〈0．01）。接种密度为4×10^4mL^-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组的卵裂率大于接种密度为2×10^4mL^-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组和对照组，但差异不显著；胚胎发育率极显著地低于接种密度为2×10^4mL^-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组和对照组。【结论】制备的传代牛胎儿睾丸SCs饲养层，能有效促进牛体外受精卵的体外发育，提高囊胚发育率；接种的传代牛胎儿睾丸SCs饲养层密度过大，将严重影响牛体外受精卵的发育。

地塞米松对体外培养人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的：研究地塞米松（DEX）对体外培养人牙周膜成纤维（PDLF）细胞增殖的影响，寻找体外培养人PDLF（hPDLF）细胞的优化条件，为牙周组织再生的研究工作奠定基础。方法：体外分离培养的hPDLF细胞随机分为5组，分别用5种含10％胎牛血清的DMEM细胞培养基培养5～8代：①空白对照组（无DEX）；②含5mg·L^-1 DEX；③含10mg·L^-1 DEX；④含20mg·L^-1 DEX；⑤含50mg·L^-1 DEX。以MTT法测定DEX对hPDLF细胞增殖率的影响；采用倒置相差显微镜观察hPDLF细胞在添加不同浓度DEX的胎牛血清培养基中培养后的细胞形态学改变。结果：将hPDLF细胞接种于24孔板后的第3天，细胞出现汇合现象。细胞在孔底呈鳞片状。采用DEX条件DMEM细胞培养液培养，可见细胞逐渐变成多层，细胞形态变小，突起变钝。MTT法检测结果表明含不同浓度DEX的DMEM培养基中培养的hPDLF细胞数均高于对照组（P〈0．05）；不同浓度的DEX对hPDLF细胞增殖均有影响（P〈0．05），且随着浓度增加，hPDLF细胞增殖能力逐渐增高。结论：DEX能使体外培养的hPDLF细胞表现很强的增殖活性。

水牛胎儿成纤维细胞体外培养体系的初步建立

为探讨适合水牛胎儿成纤维细胞(BFF)的体外培养体系,采用常规组织块法和胰蛋白酶消化法原代培养BFF均获得了较多的成纤维细胞,但后者所得细胞的活力不如前者高,且死细胞也较多;传代或冻存成纤维细胞时用4℃预冷的胰蛋白酶室温下消化所得的细胞比37℃热消化的细胞更圆、更有光泽;跟踪32代的细胞冷冻复苏率均达70%～80%;染色体分析结果显示,二倍体细胞所占比例始终保持在80%～90%之间,各代细胞(5th、10th、15th)之间差异不显著(P>0.05)。结果表明,组织块法原代培养、4℃预冷胰蛋白酶室温消化传代细胞的培养体系比较适合水牛胎儿成纤维细胞的培养。

不同培养体系对胎牛成纤维细胞体外培养的影响

研究不同培养体系对胎牛成纤维细胞体外培养的影响及用牛血清白蛋白代替血清培养胎牛成纤维细胞的可行性。利用M199、DMEM、α-MEM、DMEM/F124种培养体系通过组织块贴壁培养对成纤维细胞体外培养液进行筛选,以α-MEM组细胞生长状况较好。分别用含2、4、6、8、10mg/mL BSA的α-MEM培养液对胎牛成纤维细胞进行原代及传代培养,5种浓度的BSA对原代培养时细胞开始游离出组织块的时间影响不明显,均在培养后的48h有成纤维细胞和上皮细胞混合游离出,但在传代培养时,胎牛成纤维细胞在8mg/mL BSA浓度的α-MEM中贴壁率较高。结果表明:培养胎牛成纤维细胞时,可用BSA代替血清,较适宜的培养体系为含8mg/mL BSA的α-MEM培养液。

牛卵母细胞孤雌激活及马-牛异质克隆胚构建

首先用不同的激活剂孤雌激活体外成熟培养的牛卵母细胞,经试验获得:离子霉素、A23187和7%乙醇联合6-DMAP可有效地激活牛卵母细胞,并支持其发育到囊胚,但离子霉素激活效率显著优于其他两种(P<0.05);以10%FBS+SOFaa+颗粒细胞为发育体系培养激活的成熟牛卵母细胞可得到较高的卵裂率和囊胚率(72.30%,14.91%)。其次,通过体外培养成年马皮肤成纤维细胞,将获得的成纤维细胞经血清饥饿培养后,作为核供体移入去核牛卵母细胞透明带下,电融合后,能得到融合的马牛重构胚,在交流电脉冲起始电压20V,持续时间10s,频率0.2MHz,结束电压15V,2次脉冲和融合间隔为0.125s的条件下,当融合电压为2.0kV/cm,脉冲时程为40μs时,重组胚的融合率和卵裂率最高(52.27%,71.74%)。

TSA对牛成纤维细胞体外培养的影响

以培养到第三代的牛成纤维细胞为研究对象,经TSA处理后,进行细胞生长曲线绘制及形态、活力、周期的检测,并通过Real-Time PCR检测Oct4和Cdx2的表达情况。当TSA浓度高于50 nmol·L-1时,细胞出现异常形态,死细胞数目增多。MTT法证明浓度为50 nmol·L-1的TSA处理牛成纤维细胞24 h显著抑制细胞活力,但对细胞染色体整倍性形象差异不显著。与对照组相比,当TSA处理牛成纤维细胞48 h时,细胞染色体整倍率显著下降。50 nmol·L-1的TSA处理牛成纤维细胞24 h,60%以上细胞细胞周期阻滞在G0/G1期。Real-Time PCR结果表明与对照组相比TSA处理后,Oct4的表达量显著升高,而Cdx2基因的表达量则显著降低。结论,TSA处理后的牛成纤维细胞作为供体细胞,可能利于克隆胚胎表观重编程及发育。

牛胎儿成纤维细胞的分离培养

研究了牛胎儿组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征,并对培养细胞的冷冻保存和复苏进行了观察。采取组织块培养法进行原代培养,在接种第5天到第6天成纤维细胞生长旺盛;用0.25%胰蛋白酶消化,传代培养细胞生长状态良好;用液氮冷冻法保存传代细胞,解冻后持续传代至第12代仍生长良好,第8代细胞冻存前和复苏后的活率分别为97.0%和94.3%,无显著差异(P>0.05);分离纯化的胎牛成纤维细胞的生长曲线都正常;成功地建立了牛胎儿成纤维细胞系。该细胞可经多次传代培养和冷冻保存。

VPA对牛胎儿成纤维细胞体外培养的影响

为了研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)丙戊酸(VPA)处理对牛胎儿成纤维细胞体外培养的影响,试验采用培养到第3代的牛胎儿成纤维细胞经VPA处理后,进行细胞生长曲线绘制及形态、活力、细胞周期的检测,并通过Real-time PCR检测Oct4和Cdx2的表达情况,经梯度浓度的VPA处理牛胎儿成纤维细胞,于24 h后观察细胞形态。结果表明:当VPA浓度高于0.5 mmol/L时,细胞开始出现异常形态,死细胞数目增多。0.5 mmol/L VPA处理牛成纤维细胞24 h可以显著抑制细胞活力,可将60%以上细胞的周期阻滞在G0/G1期;但处理48 h将导致细胞染色体整倍率显著下降。与对照组相比,VPA处理后,Oct4的表达量显著升高,而Cdx2基因的表达量则显著降低。说明用HDACIs VPA处理过的牛成纤维细胞作为体细胞核移植的供体细胞,可能更有利于克隆胚胎重编程及发育。

人AB血浆培养外周血造血干/祖细胞向成熟红细胞分化的可行性研究

目的探讨人AB血浆培养外周血造血干/祖细胞(HSCs/HPCs)向成熟红细胞分化的可行性。方法将外周血HSCs/HPCs分别在添加5%胎牛血清(FBS)(FBS组)、3%FBS+2%人AB血浆(FBS+AB血浆组)和8%人AB血浆(AB血浆组)中的培养条件下诱导分化为成熟红细胞,按照1×10;/mL密度接种在24孔培养板中,2 mL/孔,观察3种培养条件下细胞生长增殖曲线和细胞形态学(细胞涂片,May-Giemsa染色,显微镜下观察细胞形态及细胞核变化)变化情况,流式细胞仪检测细胞表面红系终末分化标志分子糖化血红蛋白A(GPA)、带3蛋白(Band3)和整合素α4(α4-integrin)表达情况,以及红系晚期细胞脱核情况;比较3种培养条件对外周血HSCs/HPCs向成熟红细胞分化的影响。结果 AB血浆组、FBS组、FBS+AB血浆组的细胞生长增殖倍数分别为2 573±116 vs 2 514±246 vs 2 539±119(P>0.05);3组细胞形态学变化相似:随着培养时间延长,HSCs/HPCs从原幼红细胞向嗜碱性幼红细胞、多染幼红细胞、正染幼红细胞分化,至21 d时,几乎全部分化为脱核的红细胞;流式检测红系终末分化及脱核:血型糖蛋白A(GPA)表达及脱核率(%)分别为97.17±1.91 vs 94.95±1.61 vs 96.15±1.38、85.1±3.26 vs 86.93±5.96 vs 86.5±3.36(P>0.05).结论人AB血浆体外培养外周HSCs/HPCs向成熟红细胞分化实验达到了与胎牛血清培养相似的结果。

血清添加时间及胚胎培养模式对产业化生产牛胚胎的影响

在利用体外受精技术产业化生产牛胚胎的体系中,体外受精卵一开始就培养在已加入犊牛血清(FBS)的改良SOF液的实验组,其卵裂率(80.6%,253/314)和可冷冻胚胎率(20.8%,129/620)与在体外受精(IVF)3 d后才往胚胎培养体系中加入FBS的结果差异不显著(相应为83.4%,262/314和24.4%,151/620,P>0.05);而囊胚率差异显著(分别为41.8%,259/620和48.5%,301/620,P<0.05)。在IVF后第3天将培养体系中的未受精卵及发育迟缓的2-细胞阶段胚胎剔除与否的不同胚胎培养模式对其后囊胚的产量和质量均无显著影响。