一种多重修饰血紫蛋白纳米氧载体的构建及体外性能检测

背景:血紫蛋白分子稳定性及生物相容性优于人和哺乳动物血红蛋白,经过修饰可能成为更加安全长效的红细胞代用品。目的:制备多重修饰血紫蛋白纳米微粒,进行理化性质表征及体外性能测试。方法:以切向流超滤法分离纯化方格星虫血紫蛋白,使用京尼平完成分子内交联,然后利用多巴胺完成纳米粒子封装,再用聚乙二醇完成钝化,获得多重修饰血紫蛋白纳米粒,表征该纳米粒的理化性质。将不同质量浓度(0,0.25,0.5,1.0,2.0 mg/mL)的血紫蛋白纳米粒、血紫蛋白、血红蛋白氧载体HBOC-201分别与巨噬细胞共同孵育6,24 h,与血管内皮细胞共同孵育24 h,采用CCK-8法检测细胞存活率,ELISA法检测血管内皮细胞培养液中一氧化氮及血管细胞黏附因子1水平。结果与结论:(1)血紫蛋白纳米粒电镜下呈现椭球形,有致密外膜,内部质地较为均匀,粒径为(150.12±1.67) nm,分散指数为0.21±0.03,Zeta电位为(-24.54±2.61) mV,半饱和氧分压为(0.97±0.15) kPa,Hill系数为1.49±0.16。(2)孵育6 h,在≤1.0 mg/mL质量浓度范围内,血紫蛋白纳米粒组、血紫蛋白组、HBOC-201组巨噬细胞存活率均在85%以上;在2.0 mg/mL质量浓度下,仅血紫蛋白纳米粒组巨噬细胞存活率在80%以上。孵育24 h,3组巨噬细胞存活率均低于80%,其中血紫蛋白纳米粒组巨噬细胞存活率高于血紫蛋白组、HBOC-201组(P <0.05)。(3)随着药物质量浓度的增加,3组血管内皮细胞存活率降低,在1.0 mg/mL或2.0 mg/mL质量浓度下,血紫蛋白纳米粒组细胞存活率高于血紫蛋白组、HBOC-201组(P <0.05);在相同质量浓度下,血紫蛋白纳米粒组一氧化氮水平高于血紫蛋白组、HBOC-201组(P <0.05);在0.25-2.0 mg/mL质量浓度范围内,血紫蛋白纳米粒组血管细胞黏附因子1水平低于血紫蛋白组、HBOC-201组(P <0.05)。(4)结果表明,经过分子内交联和聚多巴胺/聚乙二醇修饰的血紫蛋白纳米粒在体外具有良好的携氧活性,抗吞噬性能更优,细胞毒性更小。

Study of Preparation and Characteristics of Pyridoxalated Polyhemoglobin

Stroma--free hemoglobin (SFHb) was prepared from fresh or out--dated whole blood by lysing red cells. At different temperatures, pyridoxal 5--phosphate (PLP) was added in a 4:1 molar-ratio to the Hb tetramer followed by reduction with NaBH4 under N2 for 16 hrs subsequenl crosslinking by glutaraldehyde in presence of lysine for 14--16 hrs. Yielded soluble pyridoxalated polyhemoglobin (Poly Hb--P). 5%--20% gradient SDS--PAGE showed the change of the Hb molecular weight (MW) after crosslinking. Gel chromatography showed that the poly Hb--P had a continuous distribution of molecular weight with the range from about 65,000 to 600,000 Dalton. The poly Hb--P solution provided a normal oxygen carrying with 23.1 of P50, at pH 7.24 or 26.1 of P50 at pH 7.24

聚乙二醇修饰牛血红蛋白制备红细胞代用品的初步研究

目的 探讨mPEG名选择性修饰异源血红蛋白，制备红细胞代用品的可能性。方法 使用mPEG 修饰牛血红蛋白，分析其对牛血红蛋白理化性质的影响。结果 平均偶联程度达到30％，导致牛血红蛋白的电泳迁移率，吸收光谱、粘度和胶体渗透压改变。结论 尽管还有很多问题需要解决，mPEG修饰牛血红蛋白制备红细胞代用品具有深入研究的价值。

PEG修饰牛血红蛋白的计算机模拟研究

对αβ二聚牛血红蛋白晶体结构的分析和氨基酸残基溶剂可及表面积的计算表明 ,牛血红蛋白表面Lys上的氨基适合进行聚乙二醇 (PEG)修饰 ,对其修饰不会影响携氧能力 ,在此基础上设计了连接物连接PEG和牛血红蛋白。分子模拟研究结果显示PEG修饰牛血红蛋白产物是无免疫原性的。

新型蛋白质修饰剂的合成及修饰牛血红蛋白的初步研究

以L谷氨酸和己二酸为原料合成了一种新型的四官能团蛋白质修饰剂,并用核磁共振和红外光谱对其结构进行了表征。然后以其为修饰剂,对牛血红蛋白的化学修饰进行了初步的研究,并通过高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和血氧分析仪对交联牛血红蛋白的分子量和携氧性能进行了表征。结果表明,该修饰剂可以使牛血红蛋白同时在分子内和分子间发生化学交联,并较好地保持携氧能力(P50:21.7mmHg,Hill系数:2.01),因此在众多用于开发人工血液代用品的化学修饰剂中该修饰剂具有良好的应用前景。

PEG化猪血红蛋白偶联物的设计与产物分析

目的 采用结构分析和分子模拟方法修饰猪血红蛋白,制备人血代用品的可行性。方法 通过蛋白质结构分析方法比较猪血红蛋白αβ二聚体晶体表面氨基的数量及其反应活性,以分子模拟方法确定修饰产物的可能结构,以mPEG修饰猪血红蛋白,并分析修饰产物理化性质。结果 修饰产物的相对分子质量增大,平均偶联程度达到27％。结论 计算机模拟技术可以用于异源血红蛋白的修饰。

DBBF修饰猪血红蛋白对其结构和功能的影响

目的探讨双(3,5-二溴水杨酸)延胡索酸酯(DBBF)选择性修饰猪血红蛋白,制备血液代用品的可行性。方法使用DBBF选择性修饰脱氧猪血红蛋白,分析其对猪血红蛋白的高级结构和携氧能力的影响。结果DBBF选择性修饰脱氧猪血红蛋白,形成的衍生物具有明显的抗α2β2四聚体解聚的特性,其携氧能力亦得到有效改善。结论DBBF修饰猪血红蛋白制备血液代用品具有深入研究的价值。

修饰血红蛋白作为红细胞代用品的研究进展和挑战

血源紧缺和病毒污染问题推动了血液代用品的研究,以血红蛋白为代表的红细胞代用品成为研究的重点。为克服血红蛋白直接使用的毒副作用,各种修饰技术得到了迅速发展,其中包括双阿司匹林交联、戊二醛交联、棉子糖交联、聚乙二醇偶联、脂质体包埋、生物可降解高分子包埋等。其中一些技术已经形成规模化制备工艺,产品进入临床试验,有的已在个别国家上市。鉴于这项研究意义重大,我国有关研究已经起步并正在迅速发展,各国同行的研究有重要的参考价值,因此有必要对近年来血红蛋白作为红细胞的代用品研究状况进行分析,明确面临的挑战,这将有利于发展更全面和有效的研究方案,以期取得突破性进展。

血红蛋白氧载体的研究目标及新进展

背景:血红蛋白氧载体作为红细胞替代物之一,已研究40余年,至今共有3代不同的血红蛋白氧载体。第1代和第2代主要是对血红蛋白进行化学修饰,而第3代主要是将血红蛋白封装在合成膜中。目的:综述国内外血红蛋白氧载体研究的新进展。方法:以“hemoglobin-based oxygen carriers,red blood cell substitutes,artificial oxygen carriers,artificial blood”“血红蛋白氧载体,红细胞替代物,人工氧载体,人工血液”为检索词,检索2000至2019年PubMed、CNKI中国期刊全文数据库、万方数据库中收录的血红蛋白氧载体制备方法的相关文献,进行总结分析。结果与结论:①胎儿、无脊椎动物、爬行动物的血红蛋白以及β-亚基突变的血红蛋白在制备血红蛋白氧载体上有一定优点;②关于血红蛋白的修饰和封装策略有了新的进展;③联合使用其他药物能够降低血红蛋白氧载体的血管毒性;④血红蛋白氧载体在应用上有了新方向,但是新型血红蛋白氧载体作为红细胞替代物领域的研究,在未来还需要更多的动物实验和临床试验。

聚多巴胺修饰蚯蚓血红蛋白纳米氧载体的构建及性能检测

背景:蚯蚓血红蛋白分子稳定性和血管毒性反应优于哺乳动物血红蛋白,聚多巴胺改性可能进一步发挥其作为血红蛋白氧载体的优势,目前国内外尚未报道。目的:制备聚多巴胺修饰蚯蚓血红蛋白纳米氧载体,并检测其性能。方法:从赤子爱胜蚓分离提纯血红蛋白,以牛血红蛋白为对照,分别与盐酸多巴胺按1∶2质量比在pH=8.5-8.8条件下完成修饰改性,分别构建聚多巴胺表面修饰蚯蚓血红蛋白纳米微粒(PDA-HrNPs)与聚多巴胺表面修饰牛血红蛋白纳米微粒(PDA-BHbNPs),检测PDA-HrNPs的纳米微粒直径、离散度、Z电位、功能基团结构、P50及Hill系数。将不同质量浓度[0(正常对照),1.0,2.5,4.0,5.5 g/L]的两组纳米微粒分别与血管内皮细胞或巨噬细胞共培养,培养6,12,24 h后,检测巨噬细胞存活率;培养24 h后,检测血管内皮细胞存活率及培养液中NO浓度。结果与结论:(1)蚯蚓血红蛋白经聚多巴胺修饰后,红外光谱显示酰胺键谱带Ⅰ与Ⅱ持续存在,在800-1000 cm-1之间出现聚多巴胺与血红蛋白分子交联生成的新基团谱带,粒径(202.2±13.64)nm,分散指数为0.22±0.05,Z电位(1.28±0.87)mV,P50为(1.44±0.02)kPa,Hill系数1.58±0.02;(2)两种纳米微粒培养的巨噬细胞存活率均低于正常对照组(P<0.05),随着培养时间的延长,两种纳米微粒培养的巨噬细胞存活率下降;相同质量浓度下(2.5,4.0,5.5 g/L),PDA-HrNPs组培养6 h后的巨噬细胞存活率高于PDA-BHbNPs组(P<0.05);(3)培养24 h后,随着纳米微粒质量浓度的增加,两种纳米微粒培养的血管内皮细胞的存活率与培养液NO浓度下降,相同质量浓度下两种纳米微粒培养细胞的存活率与培养液NO浓度比较差异均无显著性意义(P>0.05);(4)结果表明,聚多巴胺蚯蚓血红蛋白纳米微粒在体外具有良好的携氧活性与安全性,抗吞噬性能优于聚多巴胺修饰牛血红蛋白纳米微粒。

化学修饰的牛血红蛋白初步研究——与葡聚糖共价交联<英文>

本研究用牛血红蛋白为原料,探索牛血红蛋白与葡聚糖进行共价连接的途径,成功地建立了聚合牛血红蛋白方法。实验结果表明牛血红蛋白能有效地与葡聚糖交联,增加了血红蛋白分子量,稳定了血红蛋白的结构,同时也保持了修饰后牛血红蛋白较好的氧亲和力,从而为血液代用品的研究开辟了一条途径。

人造血液基质聚合牛血红蛋白的抗原性研究

目的 通过动物实验 ,推导人造血液基质聚合牛血红蛋白 (poly BHb)输入人体后可能引起的免疫反应。方法 制备兔抗人Hb、兔Hb和poly BHb的抗体 ,研究对兔而言这 3种Hb的抗原性的强弱和它们之间抗原性的交叉程度。将大量poly BHb溶液输入家兔体内 ,观察家兔的免疫反应。通过计算机模拟 ,比较天然人、兔、牛Hb之间氨基酸序列、空间结构和抗原位点的差异。结果 天然牛Hb与人Hb分子的构象几乎一致 ,poly BHb与人Hb有高度相似的抗原性。poly BHb反复大量输入家兔体内未能测出抗体。结论 从结果初步推论 ,poly BHb溶液有限次数输入人体 ,引起免疫反应的可能性较小 ,但尚需要更多的试验及人体安全性试验加以证实。

聚乙二醇修饰牛血红蛋白作为红细胞代用品的条件优化和产物检测

目的:考察不同条件下单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(SC-mPEG)与牛血红蛋白(BHB)的反应产率,以建立分析(SC-mPEG-BHB)混合物的方法。方法:综合运用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、凝胶渗透色谱(GPC)、毛细管电泳(CE)、三硝基苯磺酸(TNBS)等方法对产物进行分析。根据不同因素对SC-mPEG修饰BHB反应的影响,确定了SC-mPEG与BHB反应的最佳体系。结果:确定的最佳分析条件为SC-mPEG与BHB最佳配比60∶1,在4℃、pH9的缓冲溶液体系反应2h。结论:本文可为后续的红细胞代用品的研究奠定基础。

聚乙二醇琥珀酰亚胺酯修饰牛血红蛋白作为红细胞代用品的条件研究

以单甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺酯(Succinimidyl carbonate methoxy polyethylene glycol,SC-mPEG)为修饰剂对牛血红蛋白(Bovine hemoglobin,BHB)进行了修饰,考察了不同条件下,SC-mPEG与牛血红蛋白反应的产率,并且建立了SC-mPEG-BHB混合物的分析方法。根据不同反应因素对SC-mPEG修饰血红蛋白反应的影响确定了SC-mPEG与牛血红蛋白反应的最佳条件,即SC-mPEG与牛血红蛋白最佳配比为60∶1,在4℃,pH9的缓冲溶液体系反应2h。

牛血红蛋白PLGA纳米粒的制备及其体外功能的研究

目的:利用poly(lactide-co-glycolide)(PLGA)和poly(styrene-co-4-styrene-sulfonate)(PSS)制备带负电荷的牛血红蛋白纳米粒,并对其载氧性能和体外性能进行评价。方法:采用溶剂蒸发法制备出空白的PLGA-PSS的空白纳米粒,通过改变pH值,吸附牛血红蛋白,从而制备出牛血红蛋白PLGA纳米粒。通过TEM、粒径、Zeta电位、包裹率和载药量、体外释放及其携氧能力对该纳米粒进行了综合分析。结果:Hb-PLGA-PSS-NPsTEM电镜下呈类球形,平均粒径为226.8±23.4nm,Zeta电位为-68.62mV,优化条件后最大包裹率约为99.3%,载药量约为28.6%,在37℃,pH7.4的PBS溶液中释放缓慢。通过对Hb结构的分析表明此工艺未对蛋白的结构造成影响,体外携氧实验测量了P50(29mmHg)和Hill系数(2.036),结果说明该Hb纳米微囊具有良好携氧功能。结论:成功制备了一种Hb-PLGA-PSS-NPs纳米粒,稳定性好,具有很好的携氧能力。