酸奶双菌发酵过程对不同来源IgG的影响

研究了酸奶嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌双菌混合发酵过程对牛初乳IgG,牛血IgG,猪血IgG和鸡蛋黄IgY的影响。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证实,常规的双菌发酵不会致使上述4种IgG分子降解,分别采用琼脂单向免疫扩散法(RID)和酶联免疫吸附法(ELISA)对牛初乳、牛血IgG及蛋黄IgY组分作定量分析,发现这些成分保持了原有免疫反应活性。虽然添加不同IgG基料后均可制备含有活性IgG的凝固型酸奶,但显著改变双菌发酵过程中乳源蛋白质的降解模式,添加牛血IgG,猪血IgG或者鸡蛋类IgY基料后,αs-酪蛋白和β-酪蛋白相应为发生降解的主要乳源蛋白。

液相色谱法分析牛血清中IgG的方法研究

本文以牛布氏菌病血清为例,阐述了采用两种不同原理的高效液相色谱法测定血清中IgG含量的方法。通过实验,筛选出利用Protein G柱测定血清中IgG含量的方法比较理想,该方法精密度试验的相对标准偏差为0.2%,平均回收率为95.71%,回收率试验的相对标准偏差为0.9%。并利用该方法测定不同的牛布氏菌病阳性血清中IgG的含量,与其效价(补体结合试验测定)进行比较,可知在一定范围内牛布氏菌病阳性血清中的IgG含量与其效价存在一定的趋势性对应关系。

抗牛血清IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清IgG免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用含山羊血清的培养基培养细胞,上清用间接ELISA法筛选。获得4株能稳定分泌抗牛血清IgG的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为1G5、2A8、3F5、4C5。其中2A8为IgG2a,其余3株为IgG1;腹水单抗的ELISA滴度均超过10-5;除3F5株单抗与山羊血清有交叉反应外,1G5、2A8、4C5株与人、马、猪、羊、兔、豚鼠等血清均不发生交叉反应;4株单抗与制备病毒性疫苗的基质液呈阴性反应;4株单抗识别分子量为160kD的牛血清IgG的两个不同抗原表位;4株单抗相对亲和力大小依次为4C5>2A8>1G5>3F5,相对敏感度依次为2A8>4C5>3F5>1G5;4株杂交瘤细胞株的染色体计数均大于90条,连续培养三个月以及冷冻保存半年后复苏,细胞生长良好。使用这些单抗建立的双抗体夹心法检测生物制品中的残留牛血清IgG。

两种牛乳κ-酪蛋白的间接ELISA定量检测研究

分别以免血清IgG与鸡卵黄抗体（IgY）为检测抗体,建立了两种牛乳κ-酪蛋白的间接ELISA定量方法.牛乳κ-酪蛋白分别免疫新西兰大白兔和临产母鸡,经亲和层析分离纯化后得到anti-κ-CN-IgG与anti-κ-CN-IgY两种抗体.两种抗体均与β-酪蛋白、α-乳白蛋白和乳清粉存在一定交叉反应,抗体与相应抗原进行免疫吸收后得到高特异性IgG与IgY.用吸收后的anti-κ-CN-IgG建立的间接ELISA法,当标准κ-CN质量浓度在0.098～3.125 mg/L时,A450 nm值与κ-CN的质量浓度具有线性关系,变异系数小于1％,回收率在99.10％～101.1％之间；用吸收后的anti-κ-CN-IgY检测κ-CN,在0.098～6.25 mg/L时,A450 nm值与κ-CN的质量浓度成良好的线性关系,变异系数小于2％,回收率在98％～100.8％之间.当三聚氰胺掺假量在0～20％时,两种抗体均能通过κ-CN的定量检测而实现乳品的掺假检验.

不同来源免疫球蛋白G的体外抑菌效果

本文研究4种不同来源的IgG制品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用。采用液体培养基连续稀释法对不同来源IgG做定性抑菌实验;分别培养12、24h后将其做定量平板涂布实验。30℃恒温培养下,牛初乳IgG、牛血IgG及猪血IgG对以上三种菌均具有一定抑制作用,12h的抑菌效果更显著。在本实验条件下未观察到鸡蛋IgY对上述3种细菌的抑菌效果。37℃下,仅观察到牛初乳IgG在80mg/ml浓度下对于St. aureus表现出一定抑菌作用。

牛血清IgG双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立及应用

目的建立牛血清Ig G(bovine immunoglobulin G,BIg G)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法。方法用BIg G-Fc免疫BALB/c小鼠,制备抗BIg G单抗,确定包被抗体及酶标抗体后,建立定量检测BIg G抗原的双抗体夹心ELISA方法,并验证该方法的准确度、精密度、稳定性、特异性,确定该方法的线性范围和定量限度。应用建立的方法检测不同厂家、不同批次牛血清及纯化EV71样品中BIg G抗原残留量。结果建立了以3E12D2为包被单抗(8.0μg/ml,100μl/孔),4A2G1B1-HRP为酶标抗体(1∶1 000稀释,100μl/孔)定量检测BIg G的双抗体夹心ELISA方法,该方法的线性范围为0.3~9.6 ng/ml,R^2>0.99,定量限度为0.3 ng/ml;回收率在94.1%~108.5%之间,同一实验者重复检测和不同实验者检测的变异系数均<10%;37℃放置3和6 d的稳定性均>90%;该试剂样品与BIg G可发生特异性反应,与其他动物源血清无交叉反应。9批牛血清中BIg G含量均存在差异;精纯样品较粗纯样品BSA和BIg G均明显去除,但BIg G占牛血清残留量(BSA+BIg G)的比例却明显上升。结论建立的BIg G抗原的双抗体夹心ELISA方法符合定量检测需要,可用于牛血清的质量质控及残留量检测。

BALB/c小鼠免疫复合物性肾损伤模型建立及肾损伤生物标志物初步探讨

目的构建BALB/c小鼠免疫复合物性肾损伤模型,探讨观察此类肾损伤的早期、简便、灵敏检测方法和候选生物标志物,为生物技术药物非临床安全性评价毒性试验中肾损伤检测提供参考。方法BALB/c小鼠随机分为溶媒对照组和阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)低、中、高剂量造模组,每组10只。诱导免疫时,造模组动物给予2 mg·mL^(−1) C-BSA和弗氏不完全佐剂1∶1等体积混合乳剂(1 mg·mL^(−1)、5 mL·kg^(−1)),而溶媒对照组动物给予磷酸盐(PBS)缓冲液与弗氏不完全佐剂1∶1等体积混合乳剂,sc诱导免疫,每周1次,共2次;加强免疫时,各组动物均尾iv给予C-BSA,溶媒对照组和C-BSA低、中、高剂量组剂量分别为0、2.5、5.0、10.0 mg·kg^(−1),每3天给予1次,共5次。造模期末,检测造模期末小鼠24 h尿蛋白含量;检测凝血指标,包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APPT)以及纤维蛋白原含量(Fbg);检测血清血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)以及三酰甘油(TG)水平;摘取主要脏器称质量并计算脏体比、脏脑比;HE染色和特殊染色[过碘酸-希夫(PAS)染色、Masson三色染色、过碘酸六胺银(PASM)染色]后,光学显微镜下检查肾组织形态学改变;免疫组化观察肾脏补体成分3(C3)、免疫球蛋白G(IgG)、结蛋白水平;免疫荧光观察肾脏C3水平;透射电子显微镜观察肾脏肾小球基底膜、足细胞足突的变化及毛细血管内皮细胞下有无电子致密物沉积。结果C-BSA各剂量组动物在尾iv给予C-BSA后出现不同程度精神萎靡、活动减少、皮肤发红和呼吸急促等过敏反应症状,溶媒对照组动物给药后无明显异常;在加强免疫2周后,与溶媒对照组比较,C-BSA低、中和高剂量组动物体质量增长显著缓慢(P<0.05);C-BSA低、中、高剂量组动物尿蛋白呈阳性。与溶媒对照组比较,C-BSA各组动物BUN、SCr、TG均未见规律改变,仅高剂量组动物的BUN升高,TG降低;C-BSA中、高剂量组动物PT显著降低(P<0.05),低、中剂量组动物APPT显著降低(P<0.05),低、中、高剂量组动物Fbg含量显著降低(P<0.001);C-BSA低、中、高剂量组动物肾脏的脏体比显著升高(P<0.01),且低、中和高剂量组的脾脏绝对质量和脏体比亦显著升高(P<0.05、0.01)。肾脏组织病理学检查及特殊染色检查发现C-BSA中、高剂量组动物肾小球系膜基质增加、基底膜增厚;免疫组化结果显示,与溶媒对照组比较,C-BSA低、中、高剂量组动物的C3、IgG、结蛋白表达水平均显著升高(P<0.001),高剂量组IgG水平显著高于低、中剂量组(P<0.05);免疫荧光结果显示,与溶媒对照组比较,C-BSA高剂量组C3水平显著升高(P<0.001);透射电镜结果显示C-BSA低、中、高剂量组动物肾脏肾小球基底膜增厚、足细胞足突部分融合,C-BSA中、高剂量组动物肾脏肾小球基底膜可见少量电子致密物沉积。结论成功建立了免疫复合物性肾损伤模型和早期、简便、灵敏的检测方法,C3、IgG和结蛋白可作为生物技术药物非临床安全性评价毒性试验中肾损伤检测的候选生物标志物。