胆管Boyden括约肌在胆汁排出中的作用及影响因素

］目的：研究胆管Ｂｏｙｄｅｎ括约肌在胆汁排出中的作用、机理及调控作用。方法：１６只犬，随机分为对照组，实验组（胆囊切除组）。采用电影摄影，灌注法测压，对内源性缩胆素的反应，免疫组化定量分析及超微结构观察等方法进行研究。结果：胆管Ｂｏｙｄｅｎ括约肌为低压管腔，压力为（１．３３ ± ０．２７）ｋＰａ，明显低于Ｏｄｄｉ括约肌高压区基础压（２．２５±０．０６）ｋＰａ（Ｐ＜０．０１）。Ｂｏｙｄｅｎ括约肌具有自主收缩、舒张功能，但似不受内源性缩胆素的调控。胆囊切除后Ｂｏｙｄｅｎ括约肌ａ－Ａｃｔｉｎ和Ｍｙｏｓｉｎ含量与对照组间无明显差异（Ｐ＞０．０５），超微结构的改变主要为细胞骨架的三维空间结构排列紊乱，同时伴有细胞内线粒体肿胀和分布异常。结论：在禁食期间，胆管 Ｂｏｙｄｅｎ括约肌是胆汁排泄的主要动力源。 Ｂｏｙｄｅｎ括约肌运动功能以植物神经调节为主，完整存在的胆囊是保证 Ｂｏｙｄｅｎ括约肌和 Ｏｄｄｉ括约肌之间功能统一的基础。

Boyden小室侵袭试验测定膀胱癌细胞的体外侵袭力

目的 :用Boyden小室侵袭试验测定膀胱癌细胞的体外侵袭力 ,并探索肿瘤细胞侵袭与其它生物学习性之间的关系。方法 :采用人工基底膜构建侵袭小室。测定EJ、T2 4、BIU 873个膀胱癌细胞株的体外侵袭力 ,并测定细胞的生长曲线、集落形成率、体外趋化运动性等指标 ,分析这些指标与体外侵袭力的关系。用扫描电镜观察侵袭过程中癌细胞的形态变化。结果 :EJ、T2 4、BIU - 87的侵袭细胞数分别为 :39 2 6± 13.90、77 0 0± 13 2 8、166 53± 2 7 2 0 ,癌细胞的体外侵袭力分别与细胞的体外运动性和生长曲线有密切关系。电镜下可见细胞通过变形运动穿过微孔 ,并伸出丝状伪足来协助运动。结论 :Boyden小室侵袭试验为测定体外癌细胞侵袭力较可靠的方法。肿瘤的侵袭力与细胞的某些生物学习性有关 ,因而测定有关指标也可间接判断肿瘤的侵袭力。

垂体瘤的体外侵袭模型-Boyden小室法的建立和特点

目的 探讨Boyden小室体外侵袭模型适用于侵袭性垂体瘤研究的实验条件和方法。方法 选取手术切除的新鲜垂体瘤标本 5例,体外进行原代培养,肿瘤在影像学上均为一侧或双侧的颈内动脉被完全包绕或肿瘤破入蝶窦的侵袭性表现。将不同浓度 ( 0 5×105、1 0×105、1 5×105、2 0×105 /ml)的垂体瘤细胞 250μl置入Boyden小室侵袭模型,分别培养 (6、12、18、24)h,观察不同浓度细胞在不同时间穿透基质凝胶多孔滤膜的侵袭率。结果 在第 6h,透过基质凝胶多孔滤膜的细胞还很少,随时间的延长而增多,在 12h前后增幅最明显, 18h以后有逐渐饱和的趋势;同时,随细胞浓度的增高,透过细胞比率也增加,但细胞浓度大于 1 0×105 /ml时,瘤细胞的侵袭百分率变化不显著。结论 Boyden小室侵袭模型适用于原代培养垂体瘤细胞的条件是,在 1 0×105 /ml细胞浓度下培养12h后,计算细胞的侵袭率。

内异方对子宫内膜异位症黏附侵袭的作用及机制

目的比较子宫内膜异位症(简称内异症)在位、异位子宫内膜组织与对照子宫内膜组织间的黏附侵袭能力,评价中药内异方的干预作用。方法采用Boyden侵袭小室实验、鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)异位种植及免疫组织化学EnVision方法,比较对照组子宫内膜基质细胞与内异症在位、异位子宫内膜基质细胞的侵袭能力,观察各组种植组织中黏附侵袭相关细胞因子的表达及中药内异方对其影响。结果内异症在位和异位内膜组基质细胞的穿膜数明显高于对照子宫内膜组(P<0.05);内异方、丹那唑血清处理后,内异方组的穿膜细胞数较丹那唑组显著减少(P<0.05)。与对照内膜组比较,内异症异位内膜组织种植灶中细胞间黏附因子-1(ICAM-1)及内异症在位、异位内膜组种植灶中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达显著升高(P<0.05),TIMP-1的表达明显降低(P<0.01);内异症在位内膜中,内异方、丹那唑血清均能显著降低MMP-9表达,并上调TIMP-1、ICAM-1的表达(P<0.01);内异症异位内膜中,内异方可显著降低MMP-9(P<0.01)、ICAM-1(P<0.05)的表达,丹那唑可显著降低ICAM-1表达(P<0.05)。与丹那唑比较,内异方下调MMP-9表达作用更明显(P<0.05)。结论内异症在位和异位子宫内膜存在MMP-9高表达,TIMP-1低表达,促使子宫内膜细胞易在异位侵袭种植。中药内异方可抑制异位子宫内膜基质细胞的侵袭能力及MMP-9的表达。

PDGF诱导大鼠主动脉平滑肌细胞迁移模型的建立

[目的]建立PDGF诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞(A7r5)迁移的模型。[方法]采用改良的Boyden小室法,以不同浓度(1、5、10、20、50和100 ng/mL)PDGF-BB为诱导剂,将不同浓度(1×105/mL、2×105/mL、4×105/mL)的A7r5细胞置入Boyden小室,分别培养5、7、9 h。迁移膜经Giemsa染色后,显微镜下观察迁移到下室的细胞,进行细胞计数。[结果]在无PDGF诱导时,迁移细胞数为每视野10个左右;而以10 ng/mL PDGF-BB诱导时,迁移细胞数每视野可达70个左右;当PDGF浓度达到100 ng/mL时,细胞迁移数降至每视野10个左右。随细胞浓度的增高,迁移细胞数目增加,细胞浓度为1×105/mL时,7 h迁移细胞数目为(48±8.944)个;2×105/mL细胞在5 h左右发生迁移的数目为(55±12.864)个,随时间延长而增多,在7 h前后增幅最明显,达(78±15.828)个(P<0.05);但细胞浓度为4×105/mL时,7 h迁移细胞数为(84±12.213)个(P>0.05)。[结论]以10 ng/mL PDGF-BB为诱导剂,以2×105/mL浓度接种,培养7 h建立的迁移模型为最佳。

siRNA沉默CXCR4基因对食管鳞癌细胞EC9706体外侵袭能力的影响

目的:探讨siRNA沉默CXCR4基因对食管鳞癌EC9706细胞系体外侵袭能力的影响.方法:化学合成两对针对CXCR4基因的干扰序列siRNA1和siRNA2和一对荧光标记的阴性对照siRNA,转染人食管鳞癌EC9706细胞.荧光显微镜下观察转染效率,于转染后48 h采用半定量RT-PCR和Western Blot法检测各组细胞CXCR4 mRNA和蛋白表达水平的变化,Boyden侵袭小室检测各组细胞体外侵袭能力的变化.结果:与未转染组和转染阴性对照siRNA组相比,EC9706细胞转染两对CXCR4 siRNA48 h后,CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05),转染siRNA1组CXCR4 mRNA和蛋白下降尤为明显,未转染组和转染阴性对照siRNA组之间无明显差异(P>0.05).Boyden侵袭小室结果显示,转染CXCR4siRNA1和CXCR4 siRNA2组细胞穿膜数与未转染组和转染阴性对照siRNA组相比明显下降(P<0.05),未转染组和单纯转染脂质体转染试剂组之间无明显差异(P>0.05).结论:siRNA沉默CXCR4基因降低EC9706细胞CXCR4的表达和侵袭能力,为进一步探讨CXCR4基因在食管鳞癌侵袭中的作用提供了实验基础,也为食管鳞癌的基因治疗提供了有效的靶点.

不同检测体系下骨髓源间充质干细胞迁移特征的比较

为研究不同检测体系下骨髓源间充质干细胞(MSC)迁移特征的差异,本研究利用Boydenchamber观察hSDF-1对MSC迁移的影响是否存在浓度依赖性;观察上述体系经50nmol渥曼青霉素(wortmannin),10μmol/LLY294002,50μmol/LPD98059,10μmol/LU73122,126μmol/LAMD3100以及50nmol/L维拉帕米等处理MSC后对MSC迁移的影响。结果表明:MSC迁移能力随着hSDF-1α浓度的递增而逐渐增强,并且发现Wortmannin、LY294002、PD98059、U70312、AMD3100、Verapamil对MSC迁移均有影响,其中U73122、AMD3100对MSC迁移阻断的效应最显著。结论:SDF-1/CXCR4所介导的MSC迁移可能与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)和蛋白激酶C(PKC)等信号途径有关。

抑制C-myc、整合素β_1对侵袭性垂体腺瘤侵袭力影响的研究

目的：研究c-myc基因、整合素β_1(integrinβ_1，INTβ_1)在侵袭性垂体瘤中的作用和意义，以探讨垂体腺瘤侵袭性可能的病理机制。方法：选取手术切除的新鲜垂体瘤标本12例。进行原代细胞培养，利用Boyden小室侵袭模型，分别加入c-myc抗体、INTβ_1民抗体联合抑制c-myc、INTβ_1活性，观察干预后垂体瘤细胞侵袭能力的变化。用免疫组化法和原位杂交方法，观察干预后C-myc和c-mycmRNA、INTβ_1和INTβ_1 mRNA表达的变化。结果：在加入c-myc、INTβ_1抗体后，C-myc和c-mycmRNA、INTβ_1和INTβ_1 mRNA表达水平均明显降低(各 P＜0．05)；同时伴随细胞侵袭率的显著下降(P＜0．01)。结论：INTβ_1、c-myc与肿瘤细胞的侵袭行为密切相关，抑制其表达，有助于阻止垂体瘤细胞的侵袭性生长。

趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默对大肠癌细胞体外侵袭及增殖能力的影响

目的:研究趋化性细胞因子受体CXCR4短干扰RNA(siRNA)对大肠癌细胞系体外侵袭及增殖能力的影响.方法:利用T7 RNA聚合酶体外合成以CXCR4为靶基因的siRNA,用脂质体转染大肠癌SW480细胞,同时设立空白对照组和无关对照组.于转染后48h采用RT-PCR方法检测CXCR4 mRNA水平,免疫印迹方法检测CXCR4和MT1-MMP的蛋白质水平,Boyden小室模型检测体外侵袭能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的分布情况,MTT法测定细胞增殖状况.结果:SW480细胞转染CXCR4 siRNA 48h后,与空白对照和无关对照相比,CXCR4 mRNA水平明显下调(51.53%±6.1% vs 78.4%±3.3%.P<0.01:51.53%±6.1% vs 87.4%±5.3%,P<0.01),CXCR4的蛋白质水平明显降低(47.3%±3.7% vs 107.2%±3.6%,P<0.01;47.3%±3.7% vs 114.7%±4.8%,P<0.01),MT1-MMP蛋白表达水平也明显下降(43.8%±2.5% vs 64.4%±4.4%,P<0.01;43.8%±2.5% vs 67.0%±2.9%,P<0.01),细胞的体外侵袭能力减弱(26.5%±6.1% vs 73.7%±3.4%,P<0.01;26.5%±6.1% vs 64.5%±5.7%,P<0.01),细胞周期的分布无明显差异.在无SDF-1存在的情况下,各组细胞的增殖无明显改变;经SDF-1刺激后,各组细胞增殖增加,但CXCR4 siRNA转染组细胞的增殖显著低于空白对照组和无关对照组(24h:0.55±0.03 vs 0.68±0.06,0.71±0.04,P<0.05;48h:0.67±0.04 vs 0.89±0.03,0.94±0.07,P<0.05;72 h:0.72±0.06 vs 1.36±0.08,1.53±0.07,P<0.01).以上各指标在空白对照和无关对照之间无显著性差异(P>0.05).结论:以CXCR4为靶向的siRNA能够有效下调CXCR4基因,降低SDF-1诱导的大肠癌细胞系体外侵袭能力及增殖海性.

当归注射液对人单核细胞趋化移动的作用

应用改良Ｂｏｙｄｅｎ技术研究当归注射液对健康成人外周血单核细胞趋化移动的作用。结果表明，当归注射液能使趋化移动的单核细胞数量增加，对趋化移动的距离亦有显著促进作用；并能明显消除氢化可的松对单核细胞趋化性的抑制作用。本文结果为氢化可的松与当归的联合应用提供了实验依据。

MTT比色法测定膀胱癌细胞的体外侵袭力

目的 用 MTT比色法与 Boyden小室侵袭试验相结合 ,测定膀胱癌细胞的体外侵袭力。方法 采用人工基质胶构建侵袭小室 ,将 EJ、T2 4、BIU- 87三个膀胱癌细胞株在装有趋化物的 Boyden小室内培养 12 h,加入 MTT,用自动酶标记数仪测定吸光度 ,根据光密度值确定侵袭指数。结果 三个膀胱癌细胞株的侵袭指数分别为 :EJ0 .32 6 %±0 .0 46 %、T2 40 .5 6 9%± 0 .0 44 %、BIU- 871.2 5 6 %±0 .0 6 6 %。癌细胞趋化移动性的移动率分别为 :EJ0 .5 0 8%± 0 .0 37%、T2 40 .6 72 %± 0 .0 39%、BIU - 871.5 2 4%±0 .0 43 %。结论 将 MTT比色法与 Boyden小室侵袭试验相结合 ,能较准确的测定出癌细胞的体外侵袭力 ,具有敏感准确、快速简便。

Periostin表达对鼻咽癌细胞体外侵袭行为的影响

目的探讨Periostin表达对体外鼻咽癌(NPC)细胞侵袭行为的影响及其机制。方法采用Western blotting检测激光捕获显微切割纯化的鼻咽癌间质和正常鼻咽黏膜间质、鼻咽癌低转移潜能细胞系6-10B和高转移潜能细胞系5-8F及NIH 3T3成纤维细胞中Periostin的表达水平。应用阳性脂质体法将pCMV-neo-Periostin质粒瞬时转染到NIH 3T3细胞,运用Western blotting检测转染前后NIH 3T3细胞中Periostin的表达水平,利用Boyden小室穿膜侵袭实验检测Periostin蛋白对肿瘤细胞的体外侵袭能力的影响,明胶酶谱法检测其对基质金属蛋白酶(MMPs)活性的影响。结果 Periostin在纯化的鼻咽癌间质中高表达,在纯化的正常鼻咽黏膜间质中及高转移细胞系5-8F中弱表达,在低转移细胞系6-10B及NIH 3T3细胞中不表达。瞬时转染过表达Periostin的NIH3T3细胞中Periostin的表达明显增强。Boyden小室实验提示,分泌蛋白Periostin可明显增强鼻咽癌细胞6-10B的体外侵袭能力,转染组穿膜的细胞数与空白对照组及未转染对照组比较,明显增多(P<0.01);转染组与6-10B细胞共培养后,培养上清中MMPs的活性较对照组明显增强。结论 Periostin蛋白能增强鼻咽癌细胞的侵袭能力,其机制可能与上调MMPs的活性有关。

小干扰垂体特异性转录因子-1对大鼠垂体生长激素肿瘤细胞侵袭行为的影响

目的:研究垂体特异性转录因子-1(pituitary-specific transcription factor-1,pit-1)siRNA转染大鼠GH3型垂体瘤细胞后对其生物学特性的影响。方法:设计合成pit-1 siRNA,经脂质体(lipofectin)转染大鼠垂体瘤细胞后,通过RT-PCR检测瘤细胞内pit-1 mRNA表达的变化;制备Boyden小室测定pit-1 siRNA对肿瘤细胞侵袭力和趋化作用的影响。结果:pit-1 siRNA转染大鼠GH3细胞24 h后,pit-1 mRNA和pit-1蛋白的表达明显低于阴性对照组(P<0.05)。透过基质凝胶多孔滤膜的大鼠GH3细胞瘤细胞的数量都显著低于阴性对照组(P<0.05)。结论:pit-1对大鼠垂体瘤细胞的侵袭性呈正相关,在生长激素腺瘤的发病机制中起重要作用。

Endostar对血管新生和肝癌诱导的血管新生的抑制作用

目的:研究Endostar对血管新生的抑制作用和对肝癌细胞诱导的血管新生的抑制作用。

银杏内酯B对血小板活化因子引起的巨噬细胞趋化及细胞骨架改变的影响

目的考察银杏内酯B（BN52021）对血小板活化因子（PAF）引起的小鼠腹腔巨噬细胞趋化功能的影响，并观察在有无钙离子存在的条件下PAF对与细胞骨架改变相关的丝状肌动蛋白（F—actin）聚合作用的影响，以及BN52021的作用。方法采用Boyden小室法检测化合物对小鼠腹腔巨噬细胞趋化的影响；流式细胞术检测特异性标记的巨噬细胞中F—actin的瞬时变化。结果：PAF可显著刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生趋化效应，同时可促进巨噬细胞丝状肌动蛋白的聚合，其中均以1×10^-8mol／L浓度时的作用最强。

Rab基因家族在MDA-MB-231乳腺癌细胞胞体和伪足中的差异表达

目的:以表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激MDA-MB-231乳腺癌细胞胞体和伪足分离,在此基础上,鉴定Rab基因家族在胞体和伪足中的差异表达谱。方法:运用Boyden小室技术分离EGF刺激下MDA-MB-231乳腺癌细胞的胞体和伪足,并鉴定Rab基因家族在乳腺癌细胞胞体和伪足中的差异表达谱。结果:RAB1A等21个基因在胞体中高表达,RAB7A等16个基因在伪足中高表达,RAB3B等24个基因在胞体和伪足中的表达量大体相等。结论 :本研究建立的基于Boyden小室技术的实验方法可以有效分离乳腺癌细胞的胞体和伪足,在此基础上鉴定了一类在EGF趋化刺激下乳腺癌细胞伪足中富集的Rab基因,从而为进一步深入研究乳腺癌细胞伪足伸展的确切分子机制提供新的思路和研究方向。

7肽小分子LCI-X7抑制人肝细胞癌的实验研究

目的:通过噬菌体展示体内筛选技术已获得可特异性结合多种人肝细胞肝癌细胞系和肝癌肿瘤血管7 肽小分子LCI-X7。探讨其在体内、体外对肝癌的抑制作用。方法:采用MTT、流式细胞仪、BrdU染色、Boyden小室等方法分别研究LCI- X7对人肝细胞肝癌细胞系HCCLM6细胞的增殖、凋亡、细胞周期、运动及侵袭的影响,并初步探索其治疗剂量范围。采用LM6人肝癌裸鼠模型,研究腹腔注射LCI- X7对HCCLM6肿瘤生长及转移的影响,腹腔注射5 FU(50 mg·kg 1 ·周1)为阳性对照,相同体积生理盐水为阴性对照。检测肿瘤组织CD31抗体染色的微血管密度以观察LCI- X7治疗对肿瘤血管生成的影响。结果:与具有相同氨基酸不同序列的对照肽相比,LCI X7 在0.1×10-9M至1×109M浓度范围内未能改变HCCLM6 在体外的增殖和细胞周期;而1×10-6M LCI X7可减少约70%HCCLM6 细胞的穿膜运动(P<0.05)及侵袭(P<0.05);在裸鼠实验,LCI X7(500μg·kg 1)与对照相比,显著降低肝内及肺转移率,分别为1/10 vs. 7/10及4/10 vs. 10/10(P<0.05);肿瘤微血管染色的结果显示,LCI- X7治疗可降低微血管密度至51.3%(P<0.05)。LCI- X7 治疗对裸鼠无明显毒性。结论:LCI- X7可抑制HCCLM6的运动和侵袭,并可减少HCCLM6在裸鼠体内的肝内播散和肺转移。

光遗传学技术在癫痫治疗中的探索

光遗传学技术原理的最初应用是源于2002年Zemelman等将Ch ARGe导入靶细胞从而进行神经活动调控的研究。2005年Boyden和Deisseroth等共同报道了应用一种光敏蛋白控制神经细胞活性的技术。而光遗传学的概念是2006年由Deisseroth等所提出的,是指遗传学（重组DNA技术）与光学技术相结合的一种细胞生物学研究技术方法。