Boyden小室侵袭试验测定膀胱癌细胞的体外侵袭力

目的 :用Boyden小室侵袭试验测定膀胱癌细胞的体外侵袭力 ,并探索肿瘤细胞侵袭与其它生物学习性之间的关系。方法 :采用人工基底膜构建侵袭小室。测定EJ、T2 4、BIU 873个膀胱癌细胞株的体外侵袭力 ,并测定细胞的生长曲线、集落形成率、体外趋化运动性等指标 ,分析这些指标与体外侵袭力的关系。用扫描电镜观察侵袭过程中癌细胞的形态变化。结果 :EJ、T2 4、BIU - 87的侵袭细胞数分别为 :39 2 6± 13.90、77 0 0± 13 2 8、166 53± 2 7 2 0 ,癌细胞的体外侵袭力分别与细胞的体外运动性和生长曲线有密切关系。电镜下可见细胞通过变形运动穿过微孔 ,并伸出丝状伪足来协助运动。结论 :Boyden小室侵袭试验为测定体外癌细胞侵袭力较可靠的方法。肿瘤的侵袭力与细胞的某些生物学习性有关 ,因而测定有关指标也可间接判断肿瘤的侵袭力。

Transwell侵袭小室技术的改良及其在人骨髓间充质干细胞诱导分化中的应用

目的:分离、培养和鉴定人骨髓间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs),应用改良的Transwell侵袭小室技术,探讨血管内皮生长因子(VEGF)及内皮细胞条件诱导液对其体外诱导分化中的作用。方法:采用Percoll(1·073g/ml)分离液分离骨髓单个核细胞,体外培养MSCs,流式细胞术分析鉴定MSCs的纯度,Transwell侵袭小室技术结合LSCM,实时监测MSCs在Matrigel与VEGF/内皮细胞条件诱导液构成的内皮细胞生长微环境中的运动迁移情况。结果:经Percoll分离、体外培养扩增的MSCs,细胞纯度可达95%左右;VEGF组迁移的深度虽高于对照组(P<0·05),但迁移至聚碳酸脂膜下的细胞与对照组相比,并无统计学意义(P>0·05)。内皮细胞条件诱导液促进MSCs的迁移,在Matrigel内迁移的深度及迁移至聚碳酸脂膜下的细胞均明显多于对照组(P<0·05)。结论:共聚焦激光扫描显微术与Transwell侵袭小室技术的结合,能够从时间和空间上对后者进行观察,使该实验得到改良;利用内皮细胞条件诱导液与Matrigel模拟体外内皮细胞生长的微环境,并从空间上观测了MSCs穿越人工基底膜的情况,为MSCs向内皮细胞体外诱导开辟了新的思路。

siRNA沉默CXCR4基因对食管鳞癌细胞EC9706体外侵袭能力的影响

目的:探讨siRNA沉默CXCR4基因对食管鳞癌EC9706细胞系体外侵袭能力的影响.方法:化学合成两对针对CXCR4基因的干扰序列siRNA1和siRNA2和一对荧光标记的阴性对照siRNA,转染人食管鳞癌EC9706细胞.荧光显微镜下观察转染效率,于转染后48 h采用半定量RT-PCR和Western Blot法检测各组细胞CXCR4 mRNA和蛋白表达水平的变化,Boyden侵袭小室检测各组细胞体外侵袭能力的变化.结果:与未转染组和转染阴性对照siRNA组相比,EC9706细胞转染两对CXCR4 siRNA48 h后,CXCR4 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05),转染siRNA1组CXCR4 mRNA和蛋白下降尤为明显,未转染组和转染阴性对照siRNA组之间无明显差异(P>0.05).Boyden侵袭小室结果显示,转染CXCR4siRNA1和CXCR4 siRNA2组细胞穿膜数与未转染组和转染阴性对照siRNA组相比明显下降(P<0.05),未转染组和单纯转染脂质体转染试剂组之间无明显差异(P>0.05).结论:siRNA沉默CXCR4基因降低EC9706细胞CXCR4的表达和侵袭能力,为进一步探讨CXCR4基因在食管鳞癌侵袭中的作用提供了实验基础,也为食管鳞癌的基因治疗提供了有效的靶点.

抑制C-myc、整合素β_1对侵袭性垂体腺瘤侵袭力影响的研究

目的：研究c-myc基因、整合素β_1(integrinβ_1，INTβ_1)在侵袭性垂体瘤中的作用和意义，以探讨垂体腺瘤侵袭性可能的病理机制。方法：选取手术切除的新鲜垂体瘤标本12例。进行原代细胞培养，利用Boyden小室侵袭模型，分别加入c-myc抗体、INTβ_1民抗体联合抑制c-myc、INTβ_1活性，观察干预后垂体瘤细胞侵袭能力的变化。用免疫组化法和原位杂交方法，观察干预后C-myc和c-mycmRNA、INTβ_1和INTβ_1 mRNA表达的变化。结果：在加入c-myc、INTβ_1抗体后，C-myc和c-mycmRNA、INTβ_1和INTβ_1 mRNA表达水平均明显降低(各 P＜0．05)；同时伴随细胞侵袭率的显著下降(P＜0．01)。结论：INTβ_1、c-myc与肿瘤细胞的侵袭行为密切相关，抑制其表达，有助于阻止垂体瘤细胞的侵袭性生长。

内异方对子宫内膜异位症黏附侵袭的作用及机制

目的比较子宫内膜异位症(简称内异症)在位、异位子宫内膜组织与对照子宫内膜组织间的黏附侵袭能力,评价中药内异方的干预作用。方法采用Boyden侵袭小室实验、鸡胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)异位种植及免疫组织化学EnVision方法,比较对照组子宫内膜基质细胞与内异症在位、异位子宫内膜基质细胞的侵袭能力,观察各组种植组织中黏附侵袭相关细胞因子的表达及中药内异方对其影响。结果内异症在位和异位内膜组基质细胞的穿膜数明显高于对照子宫内膜组(P<0.05);内异方、丹那唑血清处理后,内异方组的穿膜细胞数较丹那唑组显著减少(P<0.05)。与对照内膜组比较,内异症异位内膜组织种植灶中细胞间黏附因子-1(ICAM-1)及内异症在位、异位内膜组种植灶中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达显著升高(P<0.05),TIMP-1的表达明显降低(P<0.01);内异症在位内膜中,内异方、丹那唑血清均能显著降低MMP-9表达,并上调TIMP-1、ICAM-1的表达(P<0.01);内异症异位内膜中,内异方可显著降低MMP-9(P<0.01)、ICAM-1(P<0.05)的表达,丹那唑可显著降低ICAM-1表达(P<0.05)。与丹那唑比较,内异方下调MMP-9表达作用更明显(P<0.05)。结论内异症在位和异位子宫内膜存在MMP-9高表达,TIMP-1低表达,促使子宫内膜细胞易在异位侵袭种植。中药内异方可抑制异位子宫内膜基质细胞的侵袭能力及MMP-9的表达。

趋化性细胞因子受体CXCR4基因沉默对大肠癌细胞体外侵袭及增殖能力的影响

目的:研究趋化性细胞因子受体CXCR4短干扰RNA(siRNA)对大肠癌细胞系体外侵袭及增殖能力的影响.方法:利用T7 RNA聚合酶体外合成以CXCR4为靶基因的siRNA,用脂质体转染大肠癌SW480细胞,同时设立空白对照组和无关对照组.于转染后48h采用RT-PCR方法检测CXCR4 mRNA水平,免疫印迹方法检测CXCR4和MT1-MMP的蛋白质水平,Boyden小室模型检测体外侵袭能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的分布情况,MTT法测定细胞增殖状况.结果:SW480细胞转染CXCR4 siRNA 48h后,与空白对照和无关对照相比,CXCR4 mRNA水平明显下调(51.53%±6.1% vs 78.4%±3.3%.P<0.01:51.53%±6.1% vs 87.4%±5.3%,P<0.01),CXCR4的蛋白质水平明显降低(47.3%±3.7% vs 107.2%±3.6%,P<0.01;47.3%±3.7% vs 114.7%±4.8%,P<0.01),MT1-MMP蛋白表达水平也明显下降(43.8%±2.5% vs 64.4%±4.4%,P<0.01;43.8%±2.5% vs 67.0%±2.9%,P<0.01),细胞的体外侵袭能力减弱(26.5%±6.1% vs 73.7%±3.4%,P<0.01;26.5%±6.1% vs 64.5%±5.7%,P<0.01),细胞周期的分布无明显差异.在无SDF-1存在的情况下,各组细胞的增殖无明显改变;经SDF-1刺激后,各组细胞增殖增加,但CXCR4 siRNA转染组细胞的增殖显著低于空白对照组和无关对照组(24h:0.55±0.03 vs 0.68±0.06,0.71±0.04,P<0.05;48h:0.67±0.04 vs 0.89±0.03,0.94±0.07,P<0.05;72 h:0.72±0.06 vs 1.36±0.08,1.53±0.07,P<0.01).以上各指标在空白对照和无关对照之间无显著性差异(P>0.05).结论:以CXCR4为靶向的siRNA能够有效下调CXCR4基因,降低SDF-1诱导的大肠癌细胞系体外侵袭能力及增殖海性.

MTT比色法测定膀胱癌细胞的体外侵袭力

目的 用 MTT比色法与 Boyden小室侵袭试验相结合 ,测定膀胱癌细胞的体外侵袭力。方法 采用人工基质胶构建侵袭小室 ,将 EJ、T2 4、BIU- 87三个膀胱癌细胞株在装有趋化物的 Boyden小室内培养 12 h,加入 MTT,用自动酶标记数仪测定吸光度 ,根据光密度值确定侵袭指数。结果 三个膀胱癌细胞株的侵袭指数分别为 :EJ0 .32 6 %±0 .0 46 %、T2 40 .5 6 9%± 0 .0 44 %、BIU- 871.2 5 6 %±0 .0 6 6 %。癌细胞趋化移动性的移动率分别为 :EJ0 .5 0 8%± 0 .0 37%、T2 40 .6 72 %± 0 .0 39%、BIU - 871.5 2 4%±0 .0 43 %。结论 将 MTT比色法与 Boyden小室侵袭试验相结合 ,能较准确的测定出癌细胞的体外侵袭力 ,具有敏感准确、快速简便。

聚焦超声对SMMC 7721肝癌细胞体外侵袭能力的影响

目的研究聚焦超声对SMMC 7721体外侵袭能力的影响。方法聚焦超声照射肝癌细胞株SMMC 7721后,用体外侵袭实验检测存活细胞侵袭穿透人工基底膜的细胞数并与正常对照组比较。结果聚焦超声照射后存活SMMC 7721细胞侵袭穿透人工基底膜的细胞数量减少。结论聚焦超声照射后可降低存活SMMC 7721细胞的侵袭转移能力。

小干扰垂体特异性转录因子-1对大鼠垂体生长激素肿瘤细胞侵袭行为的影响

目的:研究垂体特异性转录因子-1(pituitary-specific transcription factor-1,pit-1)siRNA转染大鼠GH3型垂体瘤细胞后对其生物学特性的影响。方法:设计合成pit-1 siRNA,经脂质体(lipofectin)转染大鼠垂体瘤细胞后,通过RT-PCR检测瘤细胞内pit-1 mRNA表达的变化;制备Boyden小室测定pit-1 siRNA对肿瘤细胞侵袭力和趋化作用的影响。结果:pit-1 siRNA转染大鼠GH3细胞24 h后,pit-1 mRNA和pit-1蛋白的表达明显低于阴性对照组(P<0.05)。透过基质凝胶多孔滤膜的大鼠GH3细胞瘤细胞的数量都显著低于阴性对照组(P<0.05)。结论:pit-1对大鼠垂体瘤细胞的侵袭性呈正相关,在生长激素腺瘤的发病机制中起重要作用。

Periostin表达对鼻咽癌细胞体外侵袭行为的影响

目的探讨Periostin表达对体外鼻咽癌(NPC)细胞侵袭行为的影响及其机制。方法采用Western blotting检测激光捕获显微切割纯化的鼻咽癌间质和正常鼻咽黏膜间质、鼻咽癌低转移潜能细胞系6-10B和高转移潜能细胞系5-8F及NIH 3T3成纤维细胞中Periostin的表达水平。应用阳性脂质体法将pCMV-neo-Periostin质粒瞬时转染到NIH 3T3细胞,运用Western blotting检测转染前后NIH 3T3细胞中Periostin的表达水平,利用Boyden小室穿膜侵袭实验检测Periostin蛋白对肿瘤细胞的体外侵袭能力的影响,明胶酶谱法检测其对基质金属蛋白酶(MMPs)活性的影响。结果 Periostin在纯化的鼻咽癌间质中高表达,在纯化的正常鼻咽黏膜间质中及高转移细胞系5-8F中弱表达,在低转移细胞系6-10B及NIH 3T3细胞中不表达。瞬时转染过表达Periostin的NIH3T3细胞中Periostin的表达明显增强。Boyden小室实验提示,分泌蛋白Periostin可明显增强鼻咽癌细胞6-10B的体外侵袭能力,转染组穿膜的细胞数与空白对照组及未转染对照组比较,明显增多(P<0.01);转染组与6-10B细胞共培养后,培养上清中MMPs的活性较对照组明显增强。结论 Periostin蛋白能增强鼻咽癌细胞的侵袭能力,其机制可能与上调MMPs的活性有关。

重组BJ46a蛋白抑制B16细胞的体外侵袭及转移

目的探讨蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a的抗肿瘤侵袭及转移作用。方法以蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a为目的基因,选择杆状病毒表达系统生产重组BJ46a蛋白,纯化并测定其生物学活性;利用Alamar blue法及Transwell小室分析法评价重组蛋白对小鼠黑色素瘤细胞B16体外生长、黏附、运动和侵袭能力的影响(n=3)。结果经ProBond亲和层析纯化出的重组BJ46a蛋白具有抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的活性;经重组BJ46a蛋白处理的B16细胞穿过Matrigel的细胞数明显低于对照组(P<0.01),抑制率为84.8%。结论重组BJ46a蛋白能抑制B16细胞的侵袭转移。

Cyclin E表达对于原代乳腺癌细胞侵袭性的影响

目的:从细胞学角度探讨Cycli E表达水平与原代乳腺癌细胞侵袭之间的关系。方法:手术中无菌条件下切取乳腺癌组织,制备原代乳腺癌细胞悬液,运用Transwell小室进行原代乳腺癌细胞侵袭力实验;获取具有不同侵袭力的原代乳腺癌细胞,再用免疫荧光技术检测不同侵袭能力的原代乳腺癌细胞cyclin E的表达水平,研究两者相关性。结果:具有不同侵袭力的乳腺癌细胞表达不同强度的Cyclin E蛋白,分别计数5个高倍视野,其均数分别为81.11±17.25及31.06±4.43,P<0.05。侵袭性试验结果显示:Cyclin E阳性表达的原代乳腺癌细胞经24小时培养以后浸润到Transwell聚碳酸盐微孔滤膜下的细胞数的均值为:76.32±11.40/高倍视野;而Cyclin E阴性表达的原代乳腺癌细胞的均值为21.56±13.22/高倍视野;P<0.05。结论:Cyclin E的表达差异与原代乳腺癌细胞的侵袭性有关,Cyclin E高表达者其侵袭性显著强于Cyclin E低表达者。

芒果苷对淋巴瘤Raji细胞增殖、侵袭及相关基因Tiam1表达的影响

目的:观察芒果苷对人淋巴瘤Raji细胞增殖、侵袭能力及T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)表达的影响,以探讨芒果苷抗淋巴瘤的初步作用机制。方法:用MTT法检测芒果苷对人淋巴瘤Raji细胞增殖的影响,用Transwell侵袭实验检测芒果苷对Raji细胞侵袭能力的抑制作用,用RT-PCR法检测芒果苷作用Raji细胞后对Tiam1的mRNA表达的影响。结果:MTT法发现,不同浓度的芒果苷分别与Raji细胞共同孵育72 h后,芒果苷对Raji细胞增殖抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性。Transwell侵袭实验发现,用不同药物浓度的芒果苷作用Raji细胞24 h后,可抑制Raji细胞穿透Transwell小室,随着药物浓度的增加其穿透滤膜的细胞数明显具有剂量依赖性。分别用不同浓度的芒果苷作用Raji细胞24 h后,发现Tiam1的mRNA表达量明显减少,且呈明显的量效关系。结论:芒果苷能抑制人淋巴瘤Raji细胞的增殖和侵袭,其机制可能与同细胞侵袭有密切关系的Tiam1的mRNA表达下调有关。

上皮性卵巢癌中Survivin表达与肿瘤侵袭性的关系

目的用不同浓度的拓扑替康作用于卵巢癌细胞株浆液性卵巢癌细胞系,探讨Survivin蛋白的表达差异及浆液性卵巢癌细胞系侵袭能力的改变。方法用不同浓度的拓扑替康作用于浆液性卵巢癌细胞系细胞,应用免疫组化的方法检测细胞中Survivin蛋白的表达,同时应用体外侵袭系统(Transwell小室),并通过明胶酶谱检测基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9的表达来检测浆液性卵巢癌细胞系细胞的体外侵袭能力。结果随着拓扑替康浓度的增加,浆液性卵巢癌细胞系细胞的侵袭率降低,各组浆液性卵巢癌细胞系细胞的侵袭率比较具有显著性差异(F=385.885,P<0.05),并且各组基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9的表达减少,各组基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9表达的比较具有显著性差异(F分别为263.302、184.378,均P<0.05)。结论拓扑替康可抑制卵巢癌细胞株中Survivin蛋白的表达,从而使细胞侵袭能力下降,这为拓扑替康应用于卵巢癌的治疗提供了一定的理论依据。

SATB1基因沉默抑制食管鳞状细胞癌TE-1中肿瘤干细胞样细胞侵袭及迁移能力

背景:近来有研究证实SATB1与肿瘤的发生及发展有关,但其在肿瘤转移中的机制尚不明确。目的:观察特异性干扰SATB1基因表达对食管鳞状细胞癌TE-1中肿瘤干细胞样细胞侵袭、迁移的影响。方法:采用免疫磁珠分选法从人食管鳞状细胞癌TE-1中分选p75^(NTR)阳性细胞与p75^(NTR)阴性细胞,检测p75^(NTR)阳性细胞的体外增殖能力及克隆形成能力。取对数生长期的p75^(NTR)阳性肿瘤干细胞样细胞,转染组利用Lipofectamine 2000脂质体法将SATB1基因si RNA转染至细胞中,同时设置空载体转染的p75^(NTR)阳性细胞为对照,转染后72 h,采用Western blot法检测2组细胞SATB1蛋白表达,Transwell小室实验检测2组细胞的迁移及侵袭能力,Western blot与q RT-PCR法检测基质金属蛋白酶2/9的表达。结果与结论:(1)与p75^(NTR)阴性细胞比较,p75^(NTR)阳性细胞培养3,5,7 d的细胞增殖明显加快(P<0.05);(2)p75^(NTR)阳性细胞的克隆形成率明显高于p75^(NTR)阴性细胞(P<0.05);(3)转染后72 h后,转染组SATB1基因蛋白表达明显低于对照组(P<0.05),迁移能力与侵袭能力明显低于对照组(P<0.05),基质金属蛋白酶2/9的基因及蛋白表达明显低于对照组(P<0.05);(4)结果提示,以si RNA干扰SATB1基因后,可抑制食管鳞状细胞癌TE-1肿瘤干细胞样细胞侵袭、迁移,可能与其下调基质金属蛋白酶2/9的表达有关。

siRNA沉默MMP-2基因对肺癌A549细胞侵袭能力的影响

目的探讨siRNA靶向抑制MMP-2基因的表达对肺癌A549细胞侵袭的抑制作用。方法化学合成一对针对MMP-2基因的干扰序列siRNA和一对阴性对照的无义序列siRNA-N,转染肺癌A549细胞,同时以未转染A549细胞作为空白对照。于转染后48 h,分别采用半定量RT-PCR技术和Western blotting法从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Boyden侵袭小室检测转染MMP-2siRNA后对A549细胞侵袭能力的影响。结果与空白对照组和转染阴性对照siRNA-N组相比,A549细胞转染MMP-2 siRNA 48 h后,MMP-2基因转录水平和蛋白水平的表达均受到抑制。转染MMP-2 siRNA组细胞穿膜数与空白对照组和转染阴性对照siRNA-N组相比明显下降。结论靶向MMP-2的siRNA不仅能特异性抑制MMP-2 mRNA和蛋白的表达,且能有效抑制A549肺癌细胞的侵袭,为肺癌的基因治疗提供了有效的靶点。

垂体瘤的体外侵袭模型-Boyden小室法的建立和特点

目的 探讨Boyden小室体外侵袭模型适用于侵袭性垂体瘤研究的实验条件和方法。方法 选取手术切除的新鲜垂体瘤标本 5例,体外进行原代培养,肿瘤在影像学上均为一侧或双侧的颈内动脉被完全包绕或肿瘤破入蝶窦的侵袭性表现。将不同浓度 ( 0 5×105、1 0×105、1 5×105、2 0×105 /ml)的垂体瘤细胞 250μl置入Boyden小室侵袭模型,分别培养 (6、12、18、24)h,观察不同浓度细胞在不同时间穿透基质凝胶多孔滤膜的侵袭率。结果 在第 6h,透过基质凝胶多孔滤膜的细胞还很少,随时间的延长而增多,在 12h前后增幅最明显, 18h以后有逐渐饱和的趋势;同时,随细胞浓度的增高,透过细胞比率也增加,但细胞浓度大于 1 0×105 /ml时,瘤细胞的侵袭百分率变化不显著。结论 Boyden小室侵袭模型适用于原代培养垂体瘤细胞的条件是,在 1 0×105 /ml细胞浓度下培养12h后,计算细胞的侵袭率。

PDGF诱导大鼠主动脉平滑肌细胞迁移模型的建立

[目的]建立PDGF诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞(A7r5)迁移的模型。[方法]采用改良的Boyden小室法,以不同浓度(1、5、10、20、50和100 ng/mL)PDGF-BB为诱导剂,将不同浓度(1×105/mL、2×105/mL、4×105/mL)的A7r5细胞置入Boyden小室,分别培养5、7、9 h。迁移膜经Giemsa染色后,显微镜下观察迁移到下室的细胞,进行细胞计数。[结果]在无PDGF诱导时,迁移细胞数为每视野10个左右;而以10 ng/mL PDGF-BB诱导时,迁移细胞数每视野可达70个左右;当PDGF浓度达到100 ng/mL时,细胞迁移数降至每视野10个左右。随细胞浓度的增高,迁移细胞数目增加,细胞浓度为1×105/mL时,7 h迁移细胞数目为(48±8.944)个;2×105/mL细胞在5 h左右发生迁移的数目为(55±12.864)个,随时间延长而增多,在7 h前后增幅最明显,达(78±15.828)个(P<0.05);但细胞浓度为4×105/mL时,7 h迁移细胞数为(84±12.213)个(P>0.05)。[结论]以10 ng/mL PDGF-BB为诱导剂,以2×105/mL浓度接种,培养7 h建立的迁移模型为最佳。