BpHi008A基因的体外表达分析

BpHi008A是一种水稻诱导性防卫基因,以单拷贝序列存在,当秧苗受到褐飞虱咬食或机械损伤后,该基因便大量表达,编码一个含82个氨基酸的蛋白质.将此基因重组到表达型载体pET28a后,转化入能产生T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株中,以10%SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离并鉴定未经IPTG诱导和经IPTG诱导后不同时刻的表达产物.结果表明利用T7 RNA聚合酶/启动子表达系统可使蛋白质在大肠杆菌中高水平表达,并且表达产物的分子量约为9.6 KDa.本实验表达的蛋白质可用为抗原刺激抗体的产生,为免疫定位和Western杂交做准备.

水稻BpHi008A基因对褐飞虱取食应答及其编码产物在大肠杆菌中的高效表达

对抗虫相关蛋白BpH i008A进行了生物信息学分析,发现BpH i008A含有一个PKC磷酸化位点、一个CK2磷酸化位点、三个N-myristoylation site位点;另外,BpH i008A蛋白含有一跨膜螺旋,和位于细胞内的N-末端及伸向细胞外的C-末端.Northern分析证明褐飞虱的取食是维持BpHi008A基因的表达的必要条件.以pET28 a为载体构建了非融合表达的重组质粒,并且实现了BpHi008A基因在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中的高效表达.

葡萄糖流加策略对基因工程FR-008/杀念菌素衍生物CS103补料分批发酵过程的影响

以组合生物合成技术得到的链霉菌FR-008突变株CS103为研究对象,研究了3.7L发酵罐上维持一定葡萄糖浓度对其次级代谢产物脱羧FR-008/candicidin衍生聚酮抗生素CS103生物合成的影响。当初始葡萄糖浓度20g/L,发酵过程还原糖浓度维持在10g/L时,抗生素CS103最高产量较分批发酵最高产量相比提高30%。研究了3.7L罐上补料分批发酵生产CS103的工艺,主要考察了脉冲补料、间歇流加补料和连续流加补料三种补料分批发酵工艺,并与分批发酵进行了比较。连续流加补料维持糖浓度的效果明显,最高产量达到126.9μg/mL,与分批发酵相比提高了44%左右。

基因工程FR-008/杀念菌素脱羧衍生物发酵过程优化

以组合生物合成技术得到的基因工程FR-008／杀念菌素脱羧衍生物CS103为研究对象，在摇瓶水平进行培养条件的初步优化。确定了接种量、接种时间、发酵过程pH、装液量等初步条件。对3.7L发酵罐水平的培养条件进行优化，确定了最适搅拌转速和通气量，并初步建立了补料分批发酵工艺。结果表明，接种时间30h、接种量为10％、控制pH6.5-7.0、搅拌转速450r／min、通气量200L／h，发酵过程维持发酵液残余葡萄糖浓度5g／L左右，在3.7L发酵罐基因工程FR-008／杀念菌素脱羧衍生物CS103产量达到99.87μg／ml。本研究为基因工程FR-008／杀念菌素工业化生产工艺提供了依据。

羊口疮病毒重庆分离株008基因的原核表达及生物信息学分析

【目的】研究羊口疮病毒008蛋白的功能,用原核表达系统表达008基因,并对其进行生物信息学分析。【方法】通过重庆临床分离株扩增得到008基因片段,将其连接到pET-28a(+)载体上,构建重组表达质粒,诱导表达该蛋白;对008蛋白利用ProtScale程序分析疏水性,TMHMM server v.2.0分析跨膜区,SignalP 5.0 server预测信号肽以及通过Protean进行B细胞抗原表位预测分析。【结果】羊口疮008基因可以在E.coli中表达,重组蛋白分子量大小约为56 kd,主要以包涵体形式表达且与阳性血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性。生物信息学研究显示,008蛋白属于疏水性蛋白,无跨膜区及信号肽区域,其中B细胞表位可能存在11个。【结论】构建的pET-28a(+)-008质粒在IPTG诱导下成功表达008蛋白,008蛋白具有良好的抗原性。

MICA新等位基因MICA＊008：05的DNA序列鉴定及分析

目的：采用直接测序法及克隆测序法确认新等位基因 MICA＊008：05。方法采用 Sequence Base Typing（SBT）法分型技术对MICA的多态性进行常规基因分型，采用克隆测序法进行确认并与已知的等位基因序列进行比对。结果发现1个样本在外显子3上有1个碱基位置与国际通用MICA数据库不相符。该基因与MICA＊008：01：01相比在外显子3的碱基位置591出现突变（C→T），密码子位置174由TCC→TCT，相应编码氨基酸是同义突变。结论 DNA测序结果表明该基因序列为新的MICA等位基因，已提交GenBank，并被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为MICA＊008：05。

亚硝基胍消除链霉菌FR-008的线性质粒

【目的】利用亚硝基胍(NTG)消除链霉菌FR-008线性质粒以简化其基因组,获得背景清晰的菌株,作为抗生素异源生物合成的底盘细胞。【方法】NTG溶液处理链霉菌FR-008孢子悬液,从存活的诱变株中筛选砷敏感的突变株,再通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测线性质粒是否被消除;用生测实验定性检测各个线性质粒消除突变株杀念菌素合成的能力,最后通过HPLC定量比较突变株和野生型产生杀念菌素的差异。【结果】从103个诱变株中筛选到3株砷敏感的突变株(10#、59#、115#)。PFGE检测发现它们均丢失了大线性质粒p SSFR1,此外,42#突变株的小线性质粒p SSFR2被消除,在此基础上,第二轮NTG诱变获得了双质粒消除的突变株。大线性质粒p SSFR1消除率约为3%,小线性质粒p SSFR2消除率约为1%。发酵结果显示:10#、115#突变株杀念菌素有效组分III产量分别提高了40%和30%。【结论】首次发现NTG是一种有效消除链霉菌线性质粒的诱变剂,2株大线性质粒消除的突变株杀念菌素的产量得到提高。此方法可以用来消除特定链霉菌菌株中的巨型线性质粒以高效简化其基因组,因而是一种有效的抗生素遗传育种的方法。

口疮病毒B4R锚蛋白抑制细胞NF-κB信号通路的研究

为明确口疮病毒(ORFV)编码的B4R蛋白调节细胞N F-κB活化的作用,以ORFV ORF008基因编码的B4R蛋白为研究对象,构建真核表达载体p CM V-Flag008,转染293T细胞,首先,利用双荧光素酶报告基因系统分析B4R蛋白对NF-κB信号活化的调节作用;其次,采用W estern-blot检测B4R蛋白对NF-κB信号通路中NF-κB p65蛋白核移位和IκBα蛋白磷酸化水平的影响。结果显示,B4R蛋白对NF-κB转录因子报告载体荧光素酶活性有明显的抑制作用(P<0.05);B4R蛋白能阻止IκBα蛋白磷酸化降解过程而抑制细胞NF-κB p65蛋白核移位。由此可见,ORFV编码的B4R蛋白能抑制细胞NF-κB信号通路的活化。