水稻BpHi008A基因对褐飞虱取食应答及其编码产物在大肠杆菌中的高效表达

对抗虫相关蛋白BpH i008A进行了生物信息学分析,发现BpH i008A含有一个PKC磷酸化位点、一个CK2磷酸化位点、三个N-myristoylation site位点;另外,BpH i008A蛋白含有一跨膜螺旋,和位于细胞内的N-末端及伸向细胞外的C-末端.Northern分析证明褐飞虱的取食是维持BpHi008A基因的表达的必要条件.以pET28 a为载体构建了非融合表达的重组质粒,并且实现了BpHi008A基因在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中的高效表达.

BpHi008A基因的体外表达分析

BpHi008A是一种水稻诱导性防卫基因,以单拷贝序列存在,当秧苗受到褐飞虱咬食或机械损伤后,该基因便大量表达,编码一个含82个氨基酸的蛋白质.将此基因重组到表达型载体pET28a后,转化入能产生T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株中,以10%SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离并鉴定未经IPTG诱导和经IPTG诱导后不同时刻的表达产物.结果表明利用T7 RNA聚合酶/启动子表达系统可使蛋白质在大肠杆菌中高水平表达,并且表达产物的分子量约为9.6 KDa.本实验表达的蛋白质可用为抗原刺激抗体的产生,为免疫定位和Western杂交做准备.

日立Labospect 008AS全自动生化分析仪测定血清视黄醇结合蛋白性能验证

目的验证日立Labospect 008AS全自动生化分析仪测定血清视黄醇结合蛋白(retinol-bindning protein,RBP)的性能。方法参照美国临床实验室标准化协会指南等相关文件设计验证方案,对日立Labospect 008AS全自动生化分析仪使用免疫比浊法测定RBP的精密度、准确度、分析线性范围、携带污染率四个方面进行验证。结果使用免疫比浊法检测低值、高值两个水平RBP的批内精密度的CV分别为1.78%、0.95%,批间精密度验证CV分别为1.91%、1.11%,均小于规定的范围,准确度验证相对偏倚为-0.76%,达到相关文件要求,在13.5~122.1 mg/L内线性范围良好,携带污染率为0.55%,符合相关要求。结论日立Labospect 008AS全自动生化分析仪使用免疫比浊法确定RBP的精密度、准确度、分析线性范围、携带污染率均符合相关文件的要求,测定结果准确可靠,能较好的满足临床的需求。

Combretastatin A-4氨基糖类衍生物CPU-XT-008抑制血管内皮细胞增殖的分子机制

以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模拟肿瘤血管内皮细胞的实验模型,研究combretastatin A-4(CA-4)的氨基糖类衍生物CPU-XT-008对HUVEC的增殖、周期分布、微管蛋白聚合以及关键周期调控蛋白表达的影响。采用MTT法检测CPU-XT-008对HUVEC增殖的影响;采用流式细胞仪检测CPU-XT-008对HUVEC周期分布的影响;采用免疫荧光染色检测CPU-XT-008对HUVEC凋亡及β-tubulin微管蛋白的聚合变化;采用Western blot检测CPU-XT-008对周期蛋白Cyclin B1,Cdc2和微管蛋白β-tubulin的影响。结果表明,CPU-XT-008能以微管蛋白为靶点抑制β-tubulin微管蛋白聚合,通过上调HUVEC的细胞周期蛋白Cyclin B1水平表达,下调细胞周期依赖性激酶Cdc2蛋白水平的表达从而引发细胞G2/M期阻滞,抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。

口疮病毒B4R锚蛋白抑制细胞NF-κB信号通路的研究

为明确口疮病毒(ORFV)编码的B4R蛋白调节细胞N F-κB活化的作用,以ORFV ORF008基因编码的B4R蛋白为研究对象,构建真核表达载体p CM V-Flag008,转染293T细胞,首先,利用双荧光素酶报告基因系统分析B4R蛋白对NF-κB信号活化的调节作用;其次,采用W estern-blot检测B4R蛋白对NF-κB信号通路中NF-κB p65蛋白核移位和IκBα蛋白磷酸化水平的影响。结果显示,B4R蛋白对NF-κB转录因子报告载体荧光素酶活性有明显的抑制作用(P<0.05);B4R蛋白能阻止IκBα蛋白磷酸化降解过程而抑制细胞NF-κB p65蛋白核移位。由此可见,ORFV编码的B4R蛋白能抑制细胞NF-κB信号通路的活化。