羊口疮病毒ORF112基因缺失毒株的构建及增殖能力分析

利用同源重组技术构建羊口疮病毒(orf virus,ORFV)ORF112基因缺失毒株,为后续研制出高效、安全的ORFV基因工程疫苗提供候选毒株。以ORF112基因为靶基因,通过重叠PCR的方法将左、右同源臂及绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达框,进行融合后与pUC19T载体连接,构建出pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP基因转移载体。将转移载体重组质粒转染到Vero细胞与WT-ORFV基因组进行同源重组。采取有限稀释法和挑取单细胞克隆法,筛选并纯化出纯合的ORFV-ΔORF112-EGFP毒株,并对该基因缺失毒株遗传稳定性和增殖特性等进行研究。结果显示:利用有限稀释和挑取单细胞克隆方法,进行阳性重组病毒纯化,通过PCR验证和测序,成功地获得ORFV-ΔORF112-EGFP重组毒株。该重组毒株在系列传代过程中EGFP稳定表达且无减弱现象。该重组ORFV-ΔORF112-EGFP毒株与野生毒株的复制生长特性基本一致。成功构建并筛选得到纯化的ORFV-ΔORF112-EGFP基因缺失毒株,该毒株具有良好的遗传稳定性和复制能力,为后续ORFV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株。

白桦 BpbHLH112 基因克隆及其启动子表达特性分析

克隆白桦BpbHLH112基因的编码序列,并进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同胁迫处理下的表达模式,进一步克隆了BpbHLH112基因上游1446 bp的启动子区域,序列分析表明,该区域含有多个逆境响应、激素响应以及信号转导等相关元件,通过构建BpbHLH112启动子片段融合GUS报告基因的表达载体并进行烟草瞬时转化,分析在不同胁迫处理条件下BpbHLH112启动子驱动GUS基因表达的活性,结果表明BpbHLH112启动子的表达能够被一些逆境胁迫因子诱导,本研究结果为深入研究BpbHLH112调控白桦应对非生物胁迫作用的分子机理提供了理论依据。

GW112基因siRNA对人胃癌SGC-7901细胞体外增殖的影响

目的构建靶向GW112siRNA逆转录病毒载体并筛选特异高效的RNAi靶点,研究GW112基因沉默后对胃癌SGC-7901细胞体外增殖的影响。方法应用逆转录病毒载体psilencer5.1-H1Retro构建针对GW112基因3个不同靶点的RNAi干扰载体-pSiRNA-GW112(pSi405-GW112,pSi1066-GW112,pSi1480-GW112),将脂质体法转染PT67细胞包装的病毒感染SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳定克隆,RT-PCR鉴定病毒整合,Real-timePCR筛选高效抑制靶点,CCK-8法检测对细胞体外增殖的影响。Westernblot检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果测序结果证实各干扰靶点的重组逆转录病毒载体pSiRNA-GW112构建正确。RT-PCR结果显示除亲本细胞外,经各靶点病毒上清感染的细胞均能扩增出510bp的Puro抗性基因片段。Real-TimePCR分析表明与SGC-7901亲本细胞组相比,7901-Si405,7901-Si1066及7901-Si1480组GW112的转录水平分别只有SGC-7901组的(15.50±0.01)%,(32.40±0.01)%与(57.00±0.02)%。而7901-Sc组GW112表达基本无变化。Si405,Si1066与Si1480靶点的抑制率分别为84.5%,67.6%及43.0%。沉默GW112后导致SGC-7901细胞体外增殖能力显著抑制(P<0.05),并伴随PCNA蛋白表达下调。结论构建的重组逆转录病毒载体pSiRNA-GW112能显著抑制SGC-7901细胞的体外增殖能力,且这种增殖抑制与下调的PCNA表达有关。

腺病毒介导外源性p16基因对人膀胱癌细胞系RT112的作用

目的 通过包装腺病毒介导外源性 p16基因 ,导入内源 p16基因缺失的膀胱癌细胞系 RT112 ,观察对膀胱癌细胞的生长抑制作用 ,并探讨其作用机制 .方法 构建 p16腺病毒表达载体 ,通过 2 93细胞包装 ,产生假病毒 ;应用打点杂交技术及免疫细胞化学检测外源 p16基因的表达 ;流式细胞仪检测细胞周期 ;透射电镜观察细胞凋亡情况 .结果 p16基因克隆入腺病毒载体中 ,并经包装后产生腺病毒 .感染外源性 p16基因的肿瘤细胞生长速率明显下降 ,出现 G1期阻滞 ,并使部分细胞出现凋亡 .结论 外源性 p16基因重表达可抑制膀胱肿瘤细胞的恶性生长 .

抗凋亡基因GW112在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:观察抗凋亡基因GW112(Olfactomedin 4)在胃癌组织的表达水平及临床意义。方法:采用SYBR Green I实时定量RT-PCR检测25例胃癌组织及胃癌外周正常胃组织中GW112的表达,并分析其表达情况与临床病理资料的相关性。结果:GW112基因在胃癌组织的表达水平(M=0.12)显著高于正常胃组织(M=0.02,P<0.05),在有淋巴结转移的胃癌组织中的表达(M=0.23)显著高于无淋巴结转移的胃癌组织(M=0.04,P<0.05),在肿瘤TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的胃癌组织(M=0.23)的表达显著高于Ⅰ/Ⅱ期(M=0.04,P<0.05);在年龄高(>60岁)患者的胃癌组织中的表达(M=0.25)高于年龄低(≤60岁)的患者(M=0.06,P<0.05)。在性别和分化程度上差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:GW112基因在胃癌组织中高表达,与胃癌的侵袭和转移相关,可作为胃癌侵袭、转移的标志物。

GW112基因逆转录病毒载体的构建及在胃癌SGC-7901细胞的表达研究

目的构建人GW112基因的逆转录病毒载体,并通过病毒介导其在人胃癌SGC-7901细胞的稳定表达。方法采用DNA重组技术构建并鉴定重组逆转录病毒载体pLEGFP-N1-GW112;以脂质体PT67细胞包装病毒,经病毒感染的SGC-7901细胞通过G418筛选及荧光定量PCR鉴定,建立GW112稳定过表达SGC-7901细胞株。结果成功构建了pLEGFP-N1-GW112逆转录病毒表达载体,经病毒包装的重组转录病毒成功感染SGC-7901细胞,Real-Time PCR结果显示实验组中GW112基因是对照组细胞中的4.2倍。结论逆转录病毒介导的GW112基因在胃癌SGC-7901细胞获得了稳定过表达,为进一步研究GW112在胃癌中的功能奠定了良好基础。

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。

野生型rLj-RGD3基因重组突变体rLj-112分子克隆及对HeLa细胞活性影响

为研究突变体r Lj-112蛋白的抗肿瘤活性,人工合成七鳃鳗野生型r Lj-RGD3蛋白和突变型r Lj-112蛋白,通过比较两种蛋白质的抗增殖、迁移和促凋亡的活性,确定突变体r Lj-112蛋白的生物学意义及地位。采用MTT方法检测不同浓度的r Lj-112蛋白对He La细胞增殖的抑制作用。结果表明,r Lj-112蛋白能显著抑制He La细胞的增殖,且IC50为4.3μmol/L。使用Transwell细胞培养板对b FGF诱导的He La细胞迁移实验表明,r Lj-112蛋白能抑制He La细胞的迁移。r Lj-112蛋白作用后,He La细胞经Hoechst33258和Annexin V-FITC染色结果显示,细胞均凋亡。流式细胞仪进一步证明,r Lj-112蛋白能诱导He La细胞发生凋亡,且呈剂量依赖性。由此可见,与野生型r Lj-RGD3蛋白比较,突变型r Lj-112蛋白有较高的细胞毒性作用,具有抗肿瘤的功能,有望应用于抗肿瘤基因工程药物的开发,具有重要的生物学意义。

猪流行性腹泻病毒YL112株的M基因序列分析及其在Vero细胞的传代适应性研究

为了解PEDV YL112株与其他不同来源PEDV毒株之间在分子生物学上的差异,对PEDV YL112株的M基因进行了扩增和序列分析。结果表明:PEDV YL112株与参考株的M基因核苷酸同源性在97.9%~99.8%之间,显示出高度保守性。系统进化树分析表明,PEDV YL112株与经典株CV777的亲缘关系较远,而与我国地方流行毒株HLJBY分离株以及HN-XYYYP-2007的亲缘关系较近。为进一步了解该毒株的复制特征,采用Vero细胞对PEDV YL112株进行体外细胞传代适应性研究。结果表明:经过连续传代培养后,PEDV YL112株对Vero细胞的适应性显著增强,其滴度从第5代的104.8 TCID50/0.1m L提高至第40代的10^(7.6) TCID_(50)/0.1m L。本研究对于分析PEDV的遗传变异规律、了解病毒的致病特征及开发新型疫苗等均具有重要理论和现实意义。

斑马鱼gpr112a基因敲除品系的构建

GPR112蛋白作为黏附类G蛋白偶联受体(aGPCRs)家族的一员,由GPR112基因编码。它含有7个跨膜结构域,与G蛋白相互作用行使其功能。斑马鱼作为研究脊椎动物发育的重要模式生物,其基因组中含有GPR112的同源基因gpr112a,且在幼鱼和成鱼中均有表达。为了研究GPR112在脊椎动物生存和发育中的作用,利用CRISPR-Cas9技术构建了gpr112a基因敲除斑马鱼品系。首先,合成用于靶向gpr112a基因第二外显子的一对sgRNAs,经显微注射得到F0代嵌合体斑马鱼。然后,对嵌合体与野生型斑马鱼杂交所得的F1代斑马鱼进行基因型鉴定,筛选gpr112a突变杂合子,并对其gpr112a突变等位基因进行Sanger测序,以确定gpr112a基因敲除品系的建立。之后,gpr112a突变杂合子斑马鱼自交,获得gpr112a纯合子突变斑马鱼。经显微成像并观察发现,受精后7 dpf的gpr112a突变纯合子斑马鱼并没有出现与野生型差异明显的表型,这可能是斑马鱼机体的代偿机制所致。此研究为探究GPR112基因在脊椎动物生存和发育中的作用开辟了道路。

保定市1株新型HIV-1重组毒株的近似全长基因组鉴定分析

目的对保定市新发现的1株pol区不能明确分型的HIV-1毒株(BD226AJ)进行近似全长基因组扩增,并分析其亚型、重组模式和基因特点。方法提取患者血浆中HIV-1RNA并逆转录为cDNA,使用近末端稀释法分2段对其进行近似全长基因组扩增并测序。使用jpHMM和SimPlot 3.5软件对近似全长基因组序列进行重组模式和重组断点分析,采用MEGA 6.0软件分片段构建Neighbor-joining系统进化树进一步确认重组断点的准确性。构建该近似全长基因组序列及各亚型片段Neighbor-joining系统进化树,分析该毒株的亲本来源。结果经过近似全长基因组扩增、测序、序列拼接后,获得1条长度为8830 bp的HIV-1近似全长基因组序列。重组分析结果显示,该序列是由CRF01_AE和B亚型重组形成的,其近似全长基因组序列被3个断点分成了4个亚型片段,分别为ICRF01_AE(HXB2,823—4224 nt)、Ⅱ_(B)(HXB2,4225—5991 nt)、ⅢCRF01_AE(HX B2,5992—9295 nt)、ⅣB(HXB2,9296—9406 nt)。各亚型基因片段的系统进化树分析进一步表明该序列的可能亲本来源为CRF01_AE和B亚型。HIV BLAST的结果显示,该序列与CRF112_01B的相似性为96%,系统进化树分析进一步验证该序列与北京市男男性行为者(men who have sex with men,MSM)中的CRF112_01B序列聚集。结论本研究在保定市MSM人群中发现了1例由CRF01_AE和B亚型重组的新型重组毒株CRF112_01B,提示HIV-1CRF112_01B已通过MSM人群传入河北,并开始在保定市传播,因此加强该亚型或者类似新型毒株的监测,对有关部门采取针对性防控措施和遏制新型重组毒株在本地区的传播和流行具有重要意义。

GW112 mRNA 3’端非翻译区特异性结合蛋白研究

目的:通过体外实验筛选出与GW112 mRNA 3’非翻译区临床特异性结合蛋白,并研究蛋白性质。方法:以稳定表达GW112基因的胃癌细胞SGC-7901为实验对象,体外转录法获得GW112 mRNA 3’非翻译区片段并用生物素标记,结合亲和素磁珠特异性吸附原理,从细胞总蛋白中纯化出与GW112 mRNA 3’非翻译区特异性结合蛋白。经过质谱鉴定得到蛋白信息,并用Western blot验证结果。结果:用磁珠纯化的蛋白样品经SDS-PAGE电泳后,取目的条带进行质谱分析发现存在核仁素蛋白,以核仁素单克隆抗体进行Western blot验证后发现与质谱结果一致。结论:核仁素是GW112 mRNA 3’非翻译区特异性结合蛋白的一种,并很可能对GW112 mRNA稳定性有直接影响,这为进一步揭示GW112在胃癌细胞抗凋亡机制中的作用奠定基础。

一例ABO新等位基因B112的分子生物学研究及其家系分析

目的 研究1例新的ABO亚型B112的分子机制,并对其家系进行分析.方法 应用单克隆抗体检测先证者红细胞ABO血型抗原,标准A、B、O红细胞检测先证者血清中的ABO抗体.采用聚合酶链反应（po1ymerase chain reaction,PCR）技术扩增先证者ABO基因的第5至7外显子序列,PCR产物经双酶切后直接测序分析第6和7外显子.同时采用基因组单链抽提技术分离先证者的两条单倍型,对分离的单倍型扩增后进行ABO基因测序分析.家系调查采集先证者父母的标本进行ABO血清学实验和ABO基因第6和7外显子测序分析.结果 先证者血清学表型符合B表型特性,直接测序分析显示第6和7外显子有261G/缺失、297A/G、526C/G、559C/T、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A杂合,推断基因型为BO.基因组单链抽提技术将先证者B和O基因分离后,测序得到两个等位基因为O01和B112.与B101相比,B112第559位C→T导致第187位精氨酸变成半胱氨酸.家系调查显示先证者B112基因从母亲遗传所得,母亲标本ABO血型血清学特性和测序分析结果与先证者完全一致.结论 发现1例559C＞T突变的ABO亚型新等位基因B112,其B抗原表达正常,提示α-1,3-半乳糖基转移酶第187位精氨酸变成半胱氨酸并不影响B转移酶的活性.

传染性脓疱病毒112基因的原核表达及亚细胞定位

对本实验室分离的传染性脓疱病毒(ORFV)AH-F10株的112基因进行克隆、原核表达及亚细胞定位。通过PCR方法获得其112基因,并分别构建原核表达重组质粒pET-32a-112及真核表达重组质粒pEGFP-C3-112。pET-32a-112经IPTG诱导表达,获得112蛋白并制备超免疫血清。同时将pEGFP-C3-112转染BHK21细胞,观察病毒112蛋白的亚细胞定位。结果显示,pET-32a-112在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;Western-blot结果表明,重组112蛋白具有良好的反应原性;112蛋白主要定位于细胞质中。本试验为进一步研究112蛋白的功能奠定了一定的理论基础。

口疮病毒112基因的原核表达及生物信息学分析

为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a（＋）中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a（＋）-ORFV 112,并转化到Rosetta（DE3）感受态细胞中,用IPTG进行诱导重组ORFV 112蛋白表达,并分别进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定,并运用生物信息学软件对口疮病毒112蛋白的性质和结构进行预测分析。结果表明,ORFV 112基因的大小约为861 bp;通过重组表达的融合蛋白大小约为40 ku;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该蛋白具有免疫反应原性。预测分析表明,ORFV 112蛋白分子式为C1357H2155N367O451S11,理论等电点（PI）为4.68,消光系数为23 295,脂肪指数为81.78,总平均疏水性（GRAVY）为-0.383,其二级结构主要以α-螺旋（29.37%）和无规则卷曲（40.56%）构成。本研究为深入研究口疮病毒112蛋白结构与功能及该蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

基因测序确认一例新β地中海贫血基因突变CD112(T→A)

目的报道1例中国人少见的β地中海贫血基因突变CD112(T→A)/N。方法根据血常规平均红细胞体积(MCV)和平均血红蛋白含量(MCH)以及血红蛋白电泳的HbF和HbA2对婚检和产检患者筛查地中海贫血,对可疑β地中海贫血患者采用基因扩增反向点杂交法检测常见17个位点突变。对于未发现突变者采用基因测序。结果患者携带一种中国人少见的β地贫基因突变CD112(T→A)。结论β地贫基因CD112(T→A)突变的报道丰富了中国人β地贫突变谱,对于指导婚检、产检、遗传咨询具有重要价值。

副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的构建及鉴定

为构建副猪嗜血杆菌5型galE基因缺失株,本研究通过重叠PCR构建了galE基因的上、下游同源臂,然后将其连接到pRE112载体而构建了重组自杀性质粒pRE112ΔgalE;使重组质粒pRE112ΔgalE转化大肠杆菌X7213,与副猪嗜血杆菌接合转移,应用两步法筛选galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE,用PCR方法验证galE基因的缺失突变。在此基础上进一步研究galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE的生长特性、药物敏感性、对保育猪的毒力等生物学特性。结果,副猪嗜血杆菌血清5型galE基因缺失株HPS-YA-008ΔgalE构建成功,且缺失株的毒力已经被致弱,对药物的敏感性增加。本试验的研究结果为研制更加安全的副猪嗜血杆菌弱毒疫苗提供了实验材料。

胃肠间质瘤患者遗传因素与伊马替尼药动学个体差异的相关性研究

目的探讨胃肠间质瘤（GIST）代谢酶基因多态性对伊马替尼（IM）及其代谢物去甲基伊马替尼（NDI）药动学个体差异的影响。方法回顾性分析2014—2016年在中山大学附属肿瘤医院接受400 mg/d IM辅助治疗的118例GIST患者的临床资料。采用LC-MS/MS方法检测IM和NDI血药浓度。采用MassArray方法对CYP3A4 rs2242480、CYP1A2 rs762551、CYP2C19 rs28399505和NR1I2 rs3814057进行基因分型。血药浓度与基因多态性关联分析采用Whitney U检验，P ≤ 0.05表示显著相关，0.05 〈 P 〈 0.10提示潜在相关。结果118例GIST患者中男63例，女55例，中位年龄55（44~63）岁；肿瘤原发灶位于胃87例，肠道13例，其他部位18例。所有病例均接受了标准的400 mg/d IM治疗，IM谷浓度（CIM）为（1 501.1 ± 646.8）μg/L，NDI谷浓度（CNDI）为（221.7 ± 92.5）μg/L。关联分析结果显示，CYP2C19 rs28399505与IM和NDI血药浓度显著相关，TC型杂合子携带者的CIM和CNDI均明显低于TT型纯合子[CIM：（695.4 ± 202.9）μg/L比（1518.9 ± 716.8）μg/L，P= 0.002；CNDI：（133.3 ± 59.8）μg/L比（244.5 ± 99.1）μg/L，P= 0.028]；NR1I2 rs3814057与IM和NDI血药浓度均显示出潜在相关性（CIM：P= 0.079；CNDI：P= 0.082）；而CYP3A4 rs2242480和CYP1A2 rs762551则与IM和NDI血药浓度无相关性（均P 〉 0.10）。结论CYP2C19在IM代谢过程中可能具有重要作用，其基因多态性检测或有助于临床上IM药物监测的开展和个体化治疗决策。