弓形虫缓殖子期特异性抗原1基因的克隆、表达及对重组抗原的免疫反应性分析

目的克隆与表达弓形虫缓殖子期特异性抗原1(BAG1)的基因,并分析重组抗原的免疫反应性。方法诱导体外培养的弓形虫RH株速殖子向缓殖子转化,用RT-PCR法从缓殖子期弓形虫扩增BAG1基因片段,进行序列分析;构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达;表达蛋白经次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖亲和层析纯化后,蛋白质印迹(Western blotting)分析与ELISA分析其免疫反应性。结果从缓殖子期弓形虫克隆的BAG1基因长690bp,构建的重组质粒pET32a(+)-BAG1经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组BAG1。Western blotting分析显示纯化的重组BAG1(SAG1)能被弓形虫慢性感染血清识别。ELISA结果表明重组BAG1抗原检测350份人血清弓形虫IgG抗体的阳性率为17.4%,显著高于重组SAG1抗原的阳性率12.6%(P<0.05)。结论原核表达的重组BAG1抗原具有特异的免疫反应性。

刚地弓形虫抗缓殖子期抗原1单克隆抗体的制备与应用

目的 制备弓形虫抗缓殖子期抗原1 (BAG1)的单克隆抗体,探究其在弓形虫缓殖子鉴定上的应用。方法分别收集碱性培养基(pH 8.2)诱导5 d后的弓形虫ME49虫株(体外诱导)和慢性感染后2个月的小鼠脑组织匀浆中的ME49虫株(体内形成)。提取体外诱导的弓形虫ME49虫株缓殖子总RNA, RT-PCR扩增bag1开放读码框片段,亚克隆至原核表达载体pET-28a (+),转化至BL21 (DE3)大肠埃希菌,用1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达BAG1,采用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白BAG1表达情况。取6只BALB/c小鼠,皮下注射纯化的重组BAG1蛋白(20μg/鼠) 3次后(首次免疫用弗氏完全佐剂,后两次免疫用等量弗氏不完全佐剂,每隔2周免疫1次),选择血清抗体效价高的小鼠,取脾组织分离脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,用纯化的BAG1蛋白经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,经多次亚克隆筛选稳定分泌抗BAG1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,收集培养上清,间接ELISA法检测抗体效价和抗体亚型。取BALB/c小鼠4只,液体石蜡腹腔注射(0.5 ml/鼠) 1周后,腹腔注射单克隆杂交瘤细胞106个/鼠,2周后收集腹水,亲和色谱法纯化抗BAG1的单克隆抗体。制备体外诱导和体内形成的弓形虫裂解蛋白,以纯化后的抗BAG1单克隆抗体为一抗,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测ME49虫株中BAG1蛋白的表达情况,间接免疫荧光试验(IFA)检测ME49虫株缓殖子情况。结果RT-PCR扩增获得bag1的开放读码框片段,长690 bp,编码229个氨基酸。重组质粒pET-28a (+)-bag1经菌落PCR和测序后鉴定正确。SDS-PAGE结果显示,重组BAG1蛋白相对分子质量(Mr)约为27 000,以可溶性蛋白和包涵体形式表达。间接ELISA检测结果显示,纯化的BAG1蛋白免疫小鼠3次后,血清抗体平均效价可达1∶102 400。融合筛选获得4株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别为mAb1H03、 mAb4B04、 mAb5H07、 mAb8B12,以mAb4B04单克隆抗体效价最高,达1∶25 600,该抗体亚型为IgG1型。Western blotting结果显示,mAb4B04单克隆抗体可识别体外诱导和体内形成的ME49虫株BAG1蛋白。IFA结果显示,mAb4B04单克隆抗体可检测到体外诱导和体内形成的ME49虫株缓殖子。结论 制备了抗弓形虫BAG1的单克隆抗体,其中效价最高的mAb4B04单克隆抗体能特异性识别弓形虫ME49虫株的BAG1蛋白和缓殖子。