文昌鱼鳃组织原代培养

采用组织块培养法培养文昌鱼（Branchiostoma belcheri japonicum）鳃细胞，使用L15，M199，Eargle’s MEM为基础培养基，加入一定量的NaCl及5％，10％，20％等不同体积分数的牛血清。经条件优化后得到最适合的培养条件为2L15＋20％FBS＋0．45％NaCl，在26～28℃条件下培养，组织决贴壁后12h内就有至少4类上皮样细胞从中迁移出来，这些细胞在前3天迅速增殖，到第6天基本上达到平稳期，往后细胞开始凋亡，最长可以存活近两个星期。鳃细胞的原代培养为文昌鱼细胞体外培养的深入研究提供了实验依据。

文昌鱼胚胎的程序化冷冻保存

文昌鱼在进化和发育生物学中有重要科学研究价值,然而由于文昌鱼实验室繁殖受产卵季节等因素的限制,以其胚胎为材料的研究工作受到局限,胚胎冷冻保存是解决这一问题的有效途径之一。本文首次对文昌鱼(Branchiostoma japonicum)胚胎的程序化冷冻保存进行了研究,通过筛选合适的程序化抗冻液、适宜的胚胎发育阶段,以及比较不同平衡处理时间、植冰温度、保存温度和洗脱时间对文昌鱼胚胎冷冻保存的影响。结果表明:几种抗冻液中,A2的效果较好,对胚胎的毒性小;原肠中期胚胎较其它时期对抗冻液的耐受力更强,适宜进行冷冻保存;胚胎在抗冻液中的最佳平衡处理时间为40-50min;冷冻降温时,适宜的植冰温度为-7.0℃--10.0℃;植冰后进行程序化冷冻,目前能稳定得到存活胚胎的最低保存温度为-15℃;此外,不同的洗脱时间对胚胎的存活率无显著影响。根据优化后的条件,对文昌鱼胚胎进行程序化冷冻保存(-196℃)实验,获得1粒存活的胚胎,并孵化出膜,发育至两鳃裂时期,幼鱼共存活了8d,但形态畸形。结果提示文昌鱼胚胎冷冻保存的可行性,但需要进一步优化包括抗冻液在内的各种条件,以提高存活率。

青岛文昌鱼肾上腺髓质素基因的克隆、组织特异性表达和生物信息学分析

用PCR技术在青岛文昌鱼中克隆到肾上腺髓质素(AM)基因的全长,命名为BjAM基因.序列分析发现BjAM基因全长1805bp,开放阅读框366bp,5'-UTR为82bp,3'-UTR为595bp;进行生物信息学分析发现,BjAM蛋白序列具有AM家族成员典型的保守关键位点,预测BjAM与AM1是直系同源,与脊椎动物AM1具有类似的生物学功能.组织特异性表达分析发现BjAM在各个组织中均有表达,鳃、脊索、肝盲囊和后肠中的表达量较高.头索动物文昌鱼中AM基因克隆和生物信息学分析为进一步构建原核表达载体、探究AM蛋白的功能奠定了基础.

青岛文昌鱼AHR和ARNT的鉴定和表达分析及相互作用研究

为了探究文昌鱼中芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AHR)和芳香烃受体核转运蛋白(Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)是否参与化学防御以及是否存在类似脊椎动物的AHR-CYP信号通路,本研究通过基因克隆、系统进化分析、表达分析和蛋白互作分析等方法进行探究。本研究从青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)中鉴定出Bjahr与Bjarnt基因,系统进化分析显示Bjahr与Bjarnt较为原始。组织表达分析显示Bjahr与Bjarnt在检测的7种组织中均有表达,且均在卵巢、精巢和脊索中表达量较高。类二噁英PCB126胁迫文昌鱼后,Bjahr、Bjarnt及生物转化酶基因cyp1、cyp3、gst和sult1a在肝盲囊中的表达都有显著升高,说明这些基因参与文昌鱼的化学防御。此外,研究中还获得了文昌鱼AHR功能域部分和ARNT的体外重组蛋白。ELISA结合实验显示,文昌鱼AHR功能域能够与ARNT结合,且脊椎动物AHR的配体PCB126能够促进这两个蛋白的结合。这些结果说明,文昌鱼AHR和ARNT可能具有脊椎动物同源蛋白类似的化学防御功能,即文昌鱼中可能存在AHR-CYP信号通路。

白氏文昌鱼和日本文昌鱼的营养成分分析与评价

分析了两种文昌鱼的营养成分,结果表明白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分分别占鲜质量的81.35%、13.31%、0.82%和2.13%;而日本文昌鱼(B.japonicum)的分别占82.65%、12.76%、0.56%和1.98%.白氏文昌鱼的氨基酸总量、必需氨基酸和鲜味氨基酸分别占干质量的58.91%、20.71%和26.20%,而日本文昌鱼的分别占64.20%、22.62%和28.16%.根据氨基酸评分(AAS)或化学评分(CS),白氏文昌鱼和日本文昌鱼的第一限制性氨基酸均为色氨酸,必需氨基酸指数(EAAI)分别为60.34和64.78.白氏文昌鱼和日本文昌鱼饱和脂肪酸分别占总脂肪酸质量的26.0%和31.9%,不饱和脂肪酸分别占47.20%和46.8%,其中ω-3不饱和脂肪酸含量较高,它们都是营养价值较高、味道鲜美的海产品.

3种文昌鱼的同工酶表型比较

采用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳和生化染色方法比较白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)、日本文昌鱼(B.japonicum)和佛罗里达文昌鱼(B.floridae)的4种同工酶(苹果酸脱氢酶MDH、超氧化物歧化酶SOD、酯酶EST、淀粉酶α-AMY)的酶谱,结果显示4种同工酶酶带的数目、染色深浅及迁移率在3种文昌鱼之间的差异比较明显,可作为鉴定不同种文昌鱼的依据,但同种文昌鱼的雌雄之间以及性腺成熟前后的同工酶酶谱的差异不明显.

中国沿海2种文昌鱼遗传多样性研究

基于线粒体COI和16SrRNA基因序列,对中国沿海2种文昌鱼(Branchiostomasp.)的6个群体(厦门、湛江和茂名群体为白氏文昌鱼Branchiostoma belcheri,中国日照、青岛和威海群体为日本文昌鱼B.japonicum)进行了遗传多样性研究。结果表明:2种文昌鱼种群遗传多样性均处于较高水平,文昌鱼种内不同地理群体间的遗传分化不显著,但2种文昌鱼间存在显著的遗传分化;群体历史动态分析结果提示2种文昌鱼可能经历过群体扩张事件(白氏文昌鱼:0.238～0.587Myr;日本文昌鱼:0.339～1.043Myr);茂名群体和威海群体均表现出较高的遗传多样性水平,提示这2个群体可能分别为白氏文昌鱼和日本文昌鱼的较原始群体。

日本文昌鱼ZP蛋白氨基酸序列多样性的初步研究

ZP蛋白家族是一类具有相对保守的ZP结构域的蛋白质,通常在精卵结合过程中起作用。从日本文昌鱼(Branchiostoma japonicum)中发现一种编码927个氨基酸残基的ZP蛋白cDNA。利用SMART预测该ZP蛋白序列含有3个结构域:透明带结构域、跨膜结构域以及低复杂度区域。利用该ZP基因的整个开放阅读框,检测该基因在日本文昌鱼群体中的氨基酸序列多样性。研究结果发现,在9个日本文昌鱼个体中扩增获得序列长度为2 481～2 784 bp,编码826～927个氨基酸。氨基酸序列比对显示,存在55个变异位点,占总氨基酸残基数的5.93%(55/927),其中有2个个体的氨基酸序列分别存在9个和101个氨基酸残基的缺失,这可能与ZP基因的不同剪切有关。揭示了日本文昌鱼ZP蛋白序列多样性可能与该蛋白的结构与功能多样性具有一定的相关性。