Molecular Cloning and Sequence Analysis of Chitin Synthase cDNA from Mamestra brassicae (L.) (Lepidoptera: Noctuidae) Cuticle

Chitin is the most widespread amino polysaccharide in nature. Chitin synthase （CHS） plays an important role in chitin formation in the cuticle and the peritrophic membrane （PM） lining the midgut. Total RNA was isolated from the cuticle of Mamestra brassicae （L.） fourth instar larva, cDNA sequence was cloned by RT-PCR and Rapid Amplification of cDNA Ends （RACE）. cDNA 5 220 bp in length, contained an open reading frame of 4 704 bp coding for a polypeptide of 1 567 amino acid residues with a predicted molecular weight of 178.3 ku and its pI was 6.42. The deduced amino acid sequence from Mi brassicae （L.） shared the high level of identity with chitin synthase sequences from other insects, especially lepidopteran insects, cDNA sequence has been deposited with GenBank under accession No. GQ281761

芥菜型油菜FAE1基因序列特征及其与芥酸含量关系的初步分析

采用同源序列法对6个芥菜型油菜(Brassica juncea)品种(高芥酸、中芥酸、低芥酸)、2份白菜型油菜品种(高芥酸和低芥酸)和1份黑芥品种的FAE1基因进行克隆和测序表明,9个品种的FAE1基因编码区全长均为1522bp,不含内含子,均编码507个氨基酸残基。序列比较表明,芥菜型油菜中有两种FAE1基因序列(BjFAE1.1和BjFAE1.2),其亲缘种白菜型油菜和黑芥中各有一种FAE1基因序列(BrFAE1和BnFAE1),BjFAE1.1对应于白菜型油菜的BrFAE1,BjFAE1.2对应于黑芥的BnFAE1;BjFAE1.1和BjFAE1.2之间存在71bp处核苷酸变异和Hind III不同的酶切位点(第1415位和第1144位),蛋白质水平上存在15处氨基酸变异。比较不同芥酸含量品种的FAE1基因序列表明,BjFAE1.1基因存在2个SNP位点(第968位和第1265位),BjFAE1.2基因也有2个SNP位点(第49位和第237位),这4个SNP位点中有3个位点(第49位、第968位和第1265位)导致蛋白质水平上氨基酸的差异。其中BjFAE1.1基因第968位的碱基变化(C→T)引起的第323位氨基酸变化(Thr→Ile),能够解释芥菜型油菜和白菜型油菜高芥酸到低芥酸(中芥酸)的转变;第1265位的碱基变化(T→C)引起的第422位的氨基酸变化(Phe→Ser),能够部分解释芥菜型油菜的高芥酸到低芥酸(中芥酸)的转变,白菜型油菜的高芥酸和低芥酸品种在该位点的碱基没有变化。BjFAE1.2基因第49位的碱基变化(T→C)引起的第17位氨基酸的变化(Phe→Leu),可以解释芥菜型油菜的中芥酸变成高芥酸(低芥酸)。陕北黄芥低芥酸突变株1278-3的FAE1基因序列和国外低芥酸品种比较,只在第1265位出现变异。

羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸-4-羟化酶基因的克隆及分析

以羽衣甘蓝为材料,克隆了全长2431bp的肉桂酸-4-羟化酶基因BoC4H。它有两个内含子,mRNA为1715bp,编码一个481个氨基酸的推导蛋白,与其它植物C4H有广泛同源性。它含有细胞色素P450保守域和特征基序,如血红素结合域、E-R-R三联体、含T的结合槽基序、酶正确定向必需的铰链基序。BoC4H具有C4H/CYP73A5的大部分特征性底物结合位点基序(SRSs)和酶活性位点残基,但与拟南芥等植物C4H相比其编码区3′发生了C2242单碱基缺失和相应移码,导致其蛋白C-末端缺失/变异了36个残基,SRS6基序和其上的活性位点残基也相应缺失,因此BoC4H可能无功能或活性低。BoC4H为膜蛋白,可能定位于内质网,其二级结构主要为α-螺旋和随机卷曲。Swiss-Model不能预测出其三级结构。甘蓝中存在一个至少由5个成员构成的C4H基因家族。

菜心苯丙氨酸解氨酶基因克隆与序列分析

通过同源克隆和RACE相结合的方法,首次从菜心中克隆了苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的全长cDNA,命名为BcPAL1(GenBank登录号为GU245694)。BcPAL1全长2 476 bp,开放阅读框2 166 bp,编码721个氨基酸。经氨基酸序列多重比较发现,BcPAL1编码的氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜等植物的PAL氨基酸序列同源性大于90%,BcPAL1编码的氨基酸序列包含与拟南芥、烟草PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点。基于氨基酸序列的PAL系统进化树分析结果显示,BcPAL1编码的氨基酸序列与十字花科类植物(如拟南芥)的PAL聚为一支,说明两者的亲缘关系较近。

甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究

采用PCR和RT-PCR技术,以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆,得到的片段长度分别为732bp和455bp。序列分析表明,克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%,两条序列内含子的大小不同;同时,前者第2内含子不符合典型的GT-AG规则:即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a(+),构建融合表达质粒pET43.1a(+)-THL1,在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白,经胰岛素检测,THL1有氧化还原活性,表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。

油菜脂肪酸延长酶基因fae1片段的克隆与SNP分析

脂肪酸延长酶基因fae1是调控油菜芥酸合成的关键基因。本研究利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物,通过多聚酶链式反应(PCR)从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜(包括2个人工合成种)的12个不同品种中扩增出长1007bp的fae1基因片段。PCR产物经与克隆载体pGEM-Tvector连接和序列测定,获得12个品种的fae1基因片段的DNA序列。对来自12个不同品种的fae1基因序列进行比较分析表明:fae1基因具有高度序列保守性,扩增长度均为1007bp,核苷酸序列相似度达98%以上,氨基酸序列的保守性更高。在1007bp的区间内共发现23个SNP(singlenucleotidepolymorphism)位点,其中有11个单核苷酸变异导致了编码氨基酸的改变。人工甘蓝型油菜和天然甘蓝型油菜的fae1基因片段未发现明显差异。发现了高芥酸品种与低芥酸品种的fae1基因、以及A基因组与C基因组的fae1基因特有SNP位点。

早熟油菜成花相关基因LFY的克隆与分析

以甘蓝型油菜晚熟品种RG-8的早熟突变体RG-8M为材料,通过同源克隆法得到1个LEAFY(LFY)同源基因,命名为BnLFY。该基因cDNA全长为1 310bp,包含1个长为1 248bp的开放阅读框,编码415个氨基酸。序列分析表明,推测的氨基酸序列含双子叶植物LFY类蛋白特有的N端脯氨酸富集区、中央酸性区、亮氨酸拉链结构以及富含赖氨酸与精氨酸的碱性区;且与几种十字花科植物LFY类蛋白的氨基酸序列一致性均在84%以上。转录表达分析表明,BnLFY基因在油菜中为组成型表达。

甘蓝型油菜PEP转运子BnPPT1基因的克隆、序列分析和表达模式

磷酸烯醇式丙酮酸/磷酸转运子基因(Phosphoenolpyruvate/phosphate translocator1,PPT1)是细胞质体碳水化合物转运的一个关键基因,在植物莽草酸代谢和脂肪酸生物合成途径中起着重要作用。根据十字花科拟南芥PEP转运子AtPPT1基因序列与油菜数据库BBSRC Brassica DB中相应ESTs设计全长引物,以甘蓝型油菜(Brassica napus)幼嫩叶片基因组DNA和种子cDNA为模板,克隆到了甘蓝型油菜PEP转运子基因全长序列,命名为BnPPT1。该基因基因组gDNA全长为2 075 bp,含有8个内含子,编码区长度为1 224 bp,编码407个氨基酸。序列比对结果表明,BnPPT1与同属于十字花科拟南芥AtPPT1转运子同源性很高,仅有个别氨基酸的差异。进一步采用半定量RT-PCR分析表明,BnPPT1基因在油菜各器官中表达差异很大,在幼嫩的子叶和茎中有较高丰度的表达,在中早期发育的种子中表达丰度逐步升高,种子成熟后期没有表达,暗示该基因在油菜籽粒中油份等物质积累中有重要功能。

甘蓝夜蛾几丁质合成酶基因片段的克隆与序列分析

以甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae(L.))4龄取食期幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到部分几丁质合成酶基因的cDNA片段,该基因片段包括2295bp,编码一个含765个氨基酸残基的蛋白,分子量约为87.6ku。在765个氨基酸组成的片段中存在9个跨膜螺旋,几丁质合成酶的催化区在该序列的401～765位。序列比对表明,克隆得到昆虫几丁质合成酶基因是比较保守的,与埃及伊蚊、四斑按蚊、冈比亚按蚊、铜绿蝇、黑腹果蝇、赤拟谷盗、小菜蛾、烟草天蛾、甜菜夜蛾等其他昆虫几丁质合成酶基因相应的cDNA序列同源性为65.4%～87.8%,相应氨基酸的序列同源性达到68.0%￣96.5%。该cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号为EU160598。

甘蓝型油菜ADC基因片段的克隆及序列分析

【目的】克隆甘蓝型油菜精氨酸脱羧酶(ADC)基因的cDNA片段,为进一步获得ADC基因全长及研究其的生物学功能奠定基础。【方法】以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种中双6号的花蕾为材料,设计简并引物,采用同源克隆法扩增ADC基因的cDNA片段。【结果】成功扩增获得8个不同的ADC基因拷贝,按长度将其分为1011、999、981bp3类,8个拷贝核苷酸序列之间的同源性为81%～99%,其推导氨基酸序列之间的同源性为86%～99%。1011bp片段包含3种不同的序列S1～S3,序列间存在9个单核苷酸多态性(SNP)位点。999bp序列包含S4和S5,具有3个SNP位点,两个区段出现连续碱基缺失。981bp序列包含S6～S8,发现14个SNP位点,且第67位核苷酸出现无义突变,4个区段发生碱基缺失。序列S4～S8共同缺失第632～634、642～650位的核苷酸小片段。氨基酸同源比对和系统进化分析结果表明,8个不同ADC基因拷贝与芥菜(Brassica juncea L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、盐芥(Thellungiella halophila L.)等物种的ADC基因同源性高,亲缘关系近。【结论】所获得的8个基因拷贝即为来自于甘蓝型油菜ADC基因的片段。

甘蓝夜蛾和八字地老虎肌动蛋白基因的克隆与序列分析

肌动蛋白是细胞骨架微丝的主要组成成分,在肌肉收缩、细胞骨架形成、细胞移动等方面起重要作用。以鳞翅目夜蛾科昆虫甘蓝夜蛾Mamestra brassicae L.和八字地老虎Agrotis c-nigrum 3龄幼虫整个虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到2种昆虫的肌动蛋白的cDNA序列,甘蓝夜蛾肌动蛋白的cDNA序列含有1441个碱基,而八字地老虎肌动蛋白的cDNA序列含有1411个碱基。2种昆虫的该基因的cDNA序列均包括1个1131个碱基的开放阅读框,编码1个含376个氨基酸的蛋白。甘蓝夜蛾肌动蛋白分子量约为41.8kDa;八字地老虎肌动蛋白分子量约为41.9kDa。Prosite软件分析结果表明,甘蓝夜蛾和八字地老虎肌动蛋白氨基酸序列中存在3个肌动蛋白特征片段。GenBank数据库搜索及序列比对结果表明,甘蓝夜蛾肌动蛋白属于肌肉特异型肌动蛋白,八字地老虎肌动蛋白属于细胞质特异型肌动蛋白。2个基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号,甘蓝夜蛾肌动蛋白cDNA序列登录号为EU035314,八字地老虎肌动蛋白cDNA序列登录号为EU035315。利用RT-PCR技术在八字地老虎4龄、5龄、6龄幼虫、蛹期4个不同发育阶段和6龄期的肠道、体壁、脂肪体3种不同组织中都检测到了肌动蛋白基因在mRNA水平的表达。

芜菁花叶病毒的3’末端序列克隆与CP基因序列分析

目的：克隆芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）的3’末端序列,并进行CP基因序列分析。方法：以TuMV杭州榨菜分离物（TuMV-HZZC）接种病叶为材料,利用病毒粒子吸附法制备病毒RNA模板,经RT-PCR扩增获得了TuMV-HZZC 3’末端序列,将其克隆到PMD 18-T质粒上进行序列分析。结果：TuMV-HZZC分离物3’末端序列包括部分的Nib基因、完整的TuMVCP基因和3′-UTR,CP基因为864bp,分别编码288个氨基酸,3′-UTR序列（不包括PolyA尾巴）为213bp。经过与其他TuMV分离物的CP基因核苷酸和氨基酸比较,同源性分别达到88.0%-97.6%和91.0%-96.5%。结论：TuMV的系统进化具有典型的地域和寄主关联性。

芸薹属栽培种ALS1-3的克隆及序列分析

【目的】揭示6种芸薹属植物乙酰乳酸合成酶（ALS）基因的结构特征,为ALS酶的遗传操作和抗除草剂种质创制奠定基础。【方法】利用特异PCR方法,对甘蓝型油菜（Brassica napus L.）、甘蓝（B.oleracea）、芥菜型油菜（B.juncea）、白菜型油菜（B.rapa）、埃塞俄比亚芥（B.carinata）、黑芥（B.nigra）等6个芸薹属16份材料的ALS基因进行扩增、克隆测序及生物信息学分析。【结果】除1个B.nigra材料未扩增出任何产物外,其余参试材料中均有PCR扩增产物,共成功克隆了30个ALS基因（GenBank登录号为KM816807-KM816836）,且克隆的基因ALS1、ALS2、ALS3均不含内含子,只有一个开放阅读框。ALS1基因开放阅读框长为1 968bp,编码655个氨基酸;ALS2基因开放阅读框长为1 914bp,编码637个氨基酸;ALS3基因开放阅读框长为1 959bp,编码652个氨基酸。参试材料中,在ALS1基因中检测到7个SNP,其中4个导致氨基酸突变;在ALS2基因中检测到3个SNP,其中2个导致氨基酸突变;在ALS3基因中检测到25个SNP,其中2个导致氨基酸突变。在3类ALS蛋白中,ALS1和ALS3遗传距离较近,与ALS2的遗传距离相对较远。ALS1基因定位于C01染色体上,ALS2和ALS3基因定位于A01染色体上。【结论】参试的6个芸薹属不同材料间ALS1、ALS2、ALS3基因序列及其编码的蛋白序列均存在差异。

芥蓝BoPGIP2全长基因的分子克隆及其序列分析

1材料与方法 1．1材料与试剂试材为“中花”芥蓝，种子播于装有蛭石和珍珠岩各半的苗钵中，并在玻璃温室中生长。幼苗期取幼嫩叶片，用75％的酒精棉擦洗干净，做好标记，立即投入液氮中固定，-75℃保存备用。

甘蓝型油菜BnGS3和BnGhd7的同源克隆及其与油菜产量相关性状的关系

甘蓝型油菜为异源四倍体,基因组结构复杂,而水稻基因组与油菜基因组具有一定的共线性。本研究利用水稻产量相关基因GS3和Ghd7序列信息,通过同源克隆方法,获得了甘蓝型油菜的同源基因BnGS3和Bn Ghd7。BnGS3有6个外显子,ORF全长666 bp,编码222个氨基酸。BnGS3蛋白具有水稻GS3四个保守结构域中的VWF结构,属于A型。Bn Ghd7含有1个外显子,ORF全长1014 bp,编码337个氨基酸。Bn Ghd7蛋白具有N端的B-Box和C端的CCT两个重要的结构域。BnGS3和Bn Ghd7分别位于A2和A10连锁群,比较测序得到BnGS3的多态性标记brgs-16及Bn Ghd7的多态性标记brghd-3和ghd7-7,其中brghd-3与千粒重(P<0.05)、ghd7-7与株高(P<0.01)正相关,ghd7-7与开花期负相关(P<0.05)。上述结果表明,利用水稻功能基因序列信息克隆甘蓝型油菜的同源基因是可行的,为油菜功能基因研究提供了一种有效途径。

油菜N13和N18上含油量QTL作图区间相关候选基因克隆

以前人报道的SG-图谱和DH群体为材料,利用拟南芥脂质基因库和芸薹属EST库信息资源,选择与拟南芥中诠释的重要油脂合成相关基因高度同源的甘蓝型油菜EST和其他具有基因信息的EST序列为标记来源,发展功能基因标记加密SG图谱;对定位在N13和N18连锁群上含油量QTL区间的相关基因片段进行克隆、测序和生物信息学分析,以期获得可能与种子含油量QTL有关联的侯选基因。结果表明:在2条连锁群的3个含油量QTL区域内共连锁上6个功能基因,其中与拟南芥同源的3个基因在油脂合成途径中发挥重要作用;其双亲差异片段经克隆测序和比对分析,发现有2个在双亲间存在氨基酸水平差异;将获得的基因片段和拟南芥同源基因序列比对结果显示,二者间内含子部分核苷酸序列相似率平均为57.7%,外显子区域为86.7%,氨基酸水平上则达到89.2%。

油菜ATP硫酸化酶部分cDNA克隆及序列分析

ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase,ATPS,EC 2.7.7.4)广泛存在于动物、植物、微生物中,可催化ATP和SO42-生成APS和PPi,也可以催化此过程的逆反应。用Genbank公布的的油菜ATPS全长序列与甘蓝、拟南芥以及洋葱的序列进行比对,得到一段保守性比较强的序列。采用RT-PCR方法从油菜‘秦优8号’的叶片获得880 bp长的cDNA片段,命名为RATPS_8。序列分析和比对结果表明:RATPS_8与已报道的甘蓝、芥菜和油菜的基因同源性分别为95%、92%和91%,进化树聚类分析和预测氨基酸的BLAST结果证实,RATPS_8为油菜‘秦优8号’ATP硫酸化酶的部分基因片段。

茎瘤芥根和茎组织转录组比较分析

茎瘤芥是十字花科芸薹属植物的变种.本研究在前期的转录组测序和数字基因表达谱(DGE)测序的基础上进一步对榨菜的根组织进行了测序和分析.通过高通量RNA-Seq测序我们获得了高质量的数字基因表达谱数据超过一千万条,其中有约71%能比对到参考基因序列上.我们将根组织的数字基因表达谱数据与榨菜瘤茎膨大过程中的3个时期的数字基因表达谱数据进行了比较,获得了共有的(3组差异表达基因的交集)差异表达基因共3594个,对这些差异表达基因的表达趋势可以分为8个簇.同时对这些差异基因进行代谢途径的功能注释,发现这些差异表达基因除了在光合作用相关的途径外,主要分布在细胞壁的合成、降解以及二级代谢如类黄酮代谢等途径方面.通过对榨菜根组织的转录组测序,我们筛选得到了部分榨菜根与茎的差异表达基因,这些基因可能与榨菜的瘤茎膨大有关.

耐酸铝胁迫候选基因BjMATE的克隆与诱导表达分析

酸铝胁迫是当前南方农业生产面临的主要非生物胁迫之一。MATE(Multidrug and toxic compound extrusion protein)基因家族被报道参与多种植物耐酸铝胁迫调节,本研究以在贵州本地适应性好的芥菜品种平坝苦油菜为研究对象,克隆抗酸耐铝候选关键BjMATE基因,获得了一个长度为1428 bp的片段,生物信息学预测该基因编码一个含475个氨基酸的跨膜蛋白,共有12个跨膜结构域和2个MATE功能域。以该序列为模板进行BLAST分析,在42个物种中获得同源序列,通过MEGA X多序列比对分析发现该片段与油菜和拟南芥等物种中MATE基因同源相似性较高。针对MATE基因的表达特性,我们分析了BjMATE在酸胁迫、铝离子胁迫以及酸铝组合胁迫条件下的基因表达变化,BjMATE能被酸胁迫诱导,显著受铝离子胁迫诱导和酸铝组合胁迫诱导,BjMATE在铝胁迫和酸铝组合胁迫下的诱导速度和诱导程度要强于酸胁迫。与正常条件相比,BjMATE分别上调1.94、3.35和3.83倍,这说明BjMATE可能参与平坝苦油菜应答酸铝胁迫调节。本试验采用酶切连接的方法构建了35S:BjMATE过量表达载体,为通过基因工程手段培育本土适应强的酸铝耐受品种奠定基础。

甘蓝夜蛾两种不同类型几丁质脱乙酰基酶基因的克隆与组织特异性表达

几丁质脱乙酰基酶(chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质降解酶中的一种酶,可以将几丁质转化为壳聚糖,在昆虫几丁质代谢中具有重要作用。本研究以甘蓝夜蛾Mamestra brassicae5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,分别扩增得到甘蓝夜蛾的2类不同几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA序列。其中一种CDA含有2036个碱基,包括一个1617个碱基的开放读码框,编码一个含539个氨基酸的蛋白,分子量约为61.5ku,作者定义其为cDNA1;另一种CDA含有1312个碱基,包括一个1173个碱基的开放阅读框,编码一个含390个氨基酸的蛋白,分子量约为44.1ku,作者定义其为cDNA2。cDNA1推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区,分别是几丁质结合区、催化区和低密度脂蛋白受体区,属于CDA第1组的成员。cDNA2推导的氨基酸序列只有几丁质催化区,属于CDA第5组的成员。利用RT-PCR进行该基因的mRNA水平上的表达表明几丁质脱乙酰基酶cDNA1在幼虫取食期的唾腺、中肠、脂肪体组织表达,在体壁和马氏管中不表达,在预蛹期和蛹期表达;cDNA2只在幼虫期的中肠表达,在其他组织及时期都不表达。获得的基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号,cDNA1登录号为HQ680620,cDNA2登录号为HQ680621。