观赏羽衣甘蓝高频再生体系的建立

观赏羽衣甘蓝是一种赏食兼用的耐冻优良景观植物。为了通过基因工程手段赋予其抗虫性,并进一步提高其低温耐受性,获得新的抗性种质,本研究以优良育种品系为试材,详细探讨了影响离体培养不定芽再生的因素,建立了高效再生体系。以8份不同类型羽衣甘蓝基因型的带柄子叶、子叶、下胚轴为外植体,研究了不同基因型、不同外植体、不同的培养基激素浓度配比及添加AgNO3对不定芽诱导的影响。结果表明:无论基因型及使用的培养基,带柄子叶均为最佳外植体;不同的基因型、不同外植体其最佳的芽诱导培养基不同;筛选出两份材料,其带柄子叶分别在L6(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L)及L3(MS+6-BA1.5mg/L)培养基中不定芽诱导率为100%,下胚轴诱导率最高也能达88.33%;培养基中添加4mg/L AgNO3不利于羽衣甘蓝的不定芽诱导;再生株生根以MS+NAA0.1mg/L效果好,生根率可达100%。

羽衣甘蓝游离小孢子培养技术研究及应用

以10个羽衣甘蓝杂交种为试材进行游离小孢子培养，研究胚状体发生和小孢子胚成苗的影响因素，以及小孢子植株倍性鉴定和单倍体加倍方法。结果表明，盛花期为最佳取样时期；培养基中13%的蔗糖较为适宜；继代培养以MS＋6-BA 2 mg·L^-1＋ NAA 0.1mg·L^-1为宜，平均增殖系数为5.06；小孢子再生植株成活率74.6%；小孢子植株自然加倍率为23.33%-37.50%；单倍体试管苗的加倍处理以秋水仙素浓度70mg·L^-1，处理时间9-11d为宜，加倍率达54.55%。

羽衣甘蓝对镉的耐性和富集特征研究

以观赏绿化植物羽衣甘蓝（Brassica oleracea L.var.acephala DC.）为试验材料,采用盆栽试验,研究其对镉的耐性和富集特征,探讨羽衣甘蓝对镉污染土壤生物修复的可行性。结果显示：（1）随着镉处理浓度的增加,羽衣甘蓝干重呈先升高后降低的趋势,20-80mg·kg-1镉处理能促进植株的生长,100-120mg·kg-1镉处理虽然显著抑制了根系的生长,但是促进了地上部的生长,整体而言对全株生长无明显影响,表明羽衣甘蓝对镉有较强的耐性,且地上部的耐性高于根系。（2）所有镉处理下,羽衣甘蓝叶片的SOD、POD和APX活性较高,MDA含量和电解质渗漏率与对照无差异;而镉处理浓度高于80mg·kg^-1时,根系的SOD、CAT和APX活性显著降低,MDA含量和电解质渗漏率显著升高,引起严重的膜脂过氧化伤害,这可能是羽衣甘蓝地上部的镉耐性高于根系的原因之一。（3）羽衣甘蓝地上部的镉含量高于根系,且随着镉处理浓度的增加均逐渐增加,在镉处理浓度为120mg·kg^-1时达到最大值,分别为50.15mg·kg^-1（根系）和52.01mg·kg^-1（地上部）;植株对镉的转运系数大于1,地上部镉富集量高于根系,地上部最大富集量为每株343.19μg。研究表明,羽衣甘蓝对镉有很强的耐性和富集、转运能力,是一种良好的修复镉污染土壤的观赏绿化植物资源。

几种影响羽衣甘蓝小孢子胚状体成苗的因素

羽衣甘蓝成熟小孢子胚转到固体培养基上可直接萌发成苗。成苗率与基因型、培养基成分和培养温度有关。MS+1.0%琼脂+3%蔗糖是适宜的成苗培养基;100MG·L-1活性炭对鱼雷形胚成苗起促进作用;10℃低温培养10D可提高成苗率。

微加工西兰花流通保鲜技术研究

比较了两种预冷方式及三种保鲜剂,六种保鲜膜对微加工西兰花的保鲜效果,最终筛选出适 宜其流通保鲜的工艺流程和最佳保鲜剂保鲜膜,使微加工西兰花失重率,黄花率,开花率及腐烂率明 显降低。最终产品经检测维生素C水平较高,同时达到食用安全标准要求。

羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸-4-羟化酶基因的克隆及分析

以羽衣甘蓝为材料,克隆了全长2431bp的肉桂酸-4-羟化酶基因BoC4H。它有两个内含子,mRNA为1715bp,编码一个481个氨基酸的推导蛋白,与其它植物C4H有广泛同源性。它含有细胞色素P450保守域和特征基序,如血红素结合域、E-R-R三联体、含T的结合槽基序、酶正确定向必需的铰链基序。BoC4H具有C4H/CYP73A5的大部分特征性底物结合位点基序(SRSs)和酶活性位点残基,但与拟南芥等植物C4H相比其编码区3′发生了C2242单碱基缺失和相应移码,导致其蛋白C-末端缺失/变异了36个残基,SRS6基序和其上的活性位点残基也相应缺失,因此BoC4H可能无功能或活性低。BoC4H为膜蛋白,可能定位于内质网,其二级结构主要为α-螺旋和随机卷曲。Swiss-Model不能预测出其三级结构。甘蓝中存在一个至少由5个成员构成的C4H基因家族。

羽衣甘蓝不同组织及柱头发育实时荧光定量PCR内参基因的筛选

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)S_(13-b)S_(13-b)自交不亲和系为试材,利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术检测Actin、Cpi6、EF-1β、GAPDH、Tub-α3、Tub-α6、Ubc7候选内参基因在不同组织和5个不同发育时期柱头的表达情况,并运用ge Norm和Best Keeper软件统计分析候选内参基因的表达稳定性。在不同组织中,ge Norm软件统计分析的结果表明Tub-α6和EF-1β的表达较稳定;Best Keeper软件统计分析的结果表明Ubc7和Tub-α6的表达较稳定。在不同发育柱头中,ge Norm软件统计分析的结果表明Actin和Ubc7的表达较稳定;Best Keeper软件统计分析的结果表明EF-1β和Tub-α6的表达较稳定。以筛选到的内参基因Tub-α6和Actin,分别分析羽衣甘蓝柱头S-位点糖蛋白基因(SLG)在不同组织和不同发育时期柱头的表达水平,结果显示出SLG主要在柱头中表达,而且SLG在柱头发育成熟时期表达量达到最高。

高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析紫甘蓝和羽衣甘蓝中花色苷

应用高效液相色谱-电喷雾/四极杆飞行时间串联质谱联用技术分析了紫甘蓝和羽衣甘蓝中的花色苷成分。选用Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 mm),二元线性梯度洗脱,柱后流出液采用电喷雾四极杆飞行时间质谱的正、负离子模式进行检测。根据一级质谱的分子离子和二级质谱碎片离子,获得化合物的准确分子量信息,与相关文献报道进行比较,分别从紫甘蓝和羽衣甘蓝中分离并检测到了16种和17种花色苷,且从紫甘蓝和羽衣甘蓝中发现了锦葵-3-(p-香豆酰基)-芸香苷。本方法快速、准确,无需标准品。

羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生

以羽衣甘蓝10个品种的游离小孢子培养,研究其胚状体及其再生植株诱导方法的结果表明,琼脂糖和活性炭对诱导胚状体发生及发育有促进作用;改良MS培养基中添加0.01%的活性炭可促进植株再生;确定1/2MS+NAA0.1mg·L-1是优化生根的培养基;小孢子再生植株成活率可达74.6%。

25份羽衣甘蓝材料的亲缘关系与遗传多样性分析

【目的】探寻羽衣甘蓝材料间的亲缘关系和遗传多样性,为进一步利用国外羽衣甘蓝商业品种和自主选育新品种奠定基础。【方法】选取25份羽衣甘蓝材料,包括7个切花、17个地被和1个食用类型,分别测定24个营养性状和11个生殖性状,按照数值、二元和多态性状特征进行编码和赋值,应用UPGMA聚类法进行分析。【结果】根据营养性状的UPGMA聚类结果,当欧氏遗传距离为9.87时,25份材料被聚类为2大类群,叶型为圆叶、皱叶、裂叶的24份材料聚为一类,叶型为裂皱叶的1份材料单独聚为另一类群;当欧氏遗传距离为7.20时,25份材料被聚类为3大类群,叶型为圆叶的11份材料聚为第1类群,皱叶与裂叶的13份材料聚为第2类群,裂皱叶的1份材料单独为另一类群;当欧氏遗传距离为6.82时,25份材料依据叶型被聚类为4大类群,即圆叶类、皱叶类、裂叶类与裂皱叶类。根据生殖性状的UPGMA聚类结果,当欧氏遗传距离为4.35时,25份材料依据子房颜色被聚类为2大类群,即子房颜色为黄绿色的归为一类,紫红色的归为另一类。【结论】在24个营养性状中,叶型是决定亲缘关系远近的第1要素,其次是叶色。在4种基本叶型中,皱叶与裂叶的亲缘关系相对较近,裂皱叶与其他3种叶型的亲缘关系较远。在11个生殖性状中,子房颜色为决定亲缘关系远近的最主要因素。

五色彩叶草叶片色素的稳定性及抑菌性研究

研究五色彩叶草(Coleus blumeivar.verschaffel)叶片色素对温度、光照、pH值、酸味剂和糖类物质的稳定性,同时对色素抑菌性进行研究。结果表明:彩叶草叶片色素具耐光性,在自然光照射下仍可以保持红色,60℃以下的温度加热2h后色素颜色无变化,60℃以上彩叶草色素的热稳定性降低。该色素受pH值影响较大,pH2.0以下时该色素呈稳定红色。酸味剂、糖类物质对彩叶草叶片色素均有增色、护色作用。酸味剂比糖类效果好,持续时间长。酸味剂中乳酸的增色效果明显;糖类物质中葡萄糖的增色效果较好,但随着时间的延长,糖类物质对彩叶草色素的增色、护色效果会逐渐降低直至消失。抑菌实验表明:彩叶草叶片色素对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用,其中对枯草芽孢杆菌的抑制作用最为明显。本研究结果可为天然色素的研究及开发利用提供理论依据。

羽衣甘蓝花药培养技术体系的研究

本实验以6份羽衣甘蓝为材料进行花药培养.细胞学观察表明,当花蕾长为2.5-3.5mm,花瓣与花药长度之比为1/2～4/5时,45-65%的小孢子发育处于单核晚期,是花药培养的最佳时期.花药培养结果可见基因型不同,胚状体的诱导率有极大的差异,最容易形成胚状体的材料是Y3,诱导效率达17.74%;胚状体的出现在花药接种后的15-30天之间.培养基的种类不同,培养效果也有差异,其中以Keller培养基效果最佳;培养基中有机成份加倍,则可以显著提高胚状体的诱导效率.培养基中蔗糖的浓度对胚状体的诱导率也有显著的影响.

重金属铊胁迫羽衣甘蓝的in situ-ATR-FTIR表征

通过植物叶片光合作用消耗二氧化碳实验,实现了羽衣甘蓝光合作用的原位衰减全反射红外光谱表征。结果表明,羽衣甘蓝无论是否受到铊胁迫,其吸收峰的位置均无明显改变,其中3380 cm-1处的强吸收峰表征叶片中的水分,碳水化合物,蛋白质和酰胺化合物等;2916,2850 cm-1处的强峰以及2960 cm-1处的肩峰表征碳水化合物和脂肪族化合物等;1640 cm-1处的吸收峰表征水分。然而,通过对羽衣甘蓝叶片进行原位表征,发现表征CO2的2360和2340 cm-1双吸收峰("负峰")均从无到有,逐渐增强,说明羽衣甘蓝在进行光合作用。并且,铊胁迫组叶片二氧化碳的消耗速率明显高于空白样,即一定浓度铊胁迫会提高羽衣甘蓝的光合速率,表明羽衣甘蓝对重金属铊具有耐受的特性;结果也表明成年叶光合作用强度大于幼叶,这符合植物叶片光合作用的一般规律。

羽衣甘蓝自交不亲和系的选育及S_(13b)单倍型的鉴定

该文采用亲和指数法(种子数/自交授粉花朵数)分别在羽衣甘蓝‘赤兔’和‘白波’栽培品种的自交后代中,经过3年的自交选育获得1个自交不亲和系4·1·1和一个自交亲和系3·2·3·由于在芸苔属植物F1代杂交种的生产和自交不亲和分子机制的研究方面S单倍型鉴定是必要的,因此在该文中我们采用了PCR方法利用引物PK1和PK4获得了BoSRKx的基因组序列,此序列的大小为919bp.经过数据库检索比对后发现BoSRKx的序列与BoSRK13b的序列完全一致.通过反转录PCR的方法获得了BoSRKx的cDNA序列,结果发现BoSRKx和BoSRK13b的序列在转录水平上也是完全一致的;另一方面,我们采用SCR保守信号肽编码区和NotⅠ-oligo(dT)设计的引物获得了BoSCRx的cDNA序列,经过数据库的检索比对后发现BoSCRx的序列比BoSCR13的序列只多出3个连续的碱基.根据上述结果我们推断出Sx单倍型就是S13b单倍型;最后,通过遗传分析结合PCR-RFLP方法和DNAblot方法对自交不亲和系进行了S13b纯合体的鉴定.

羽衣甘蓝抗寒生理特性研究

观赏羽衣甘蓝作为秋冬季节重要的园林绿化植物,抗寒性直接影响其推广和应用。为了阐明羽衣甘蓝响应低温的生理特性,揭示抗寒机理,以北京市农林科学院蔬菜研究中心生物技术课题组选配的优良F1杂种作为研究试材,分析不同低温处理下叶片电导率变化和半致死温度,以及渗透调节物质含量和抗氧化酶活性的变化。结果显示,羽衣甘蓝叶片电导率在-5℃以下迅速升高,-10℃左右达到最大值;半致死温度为-10.3^-13.7℃,红色类型低于白色类型,羽叶和圆叶低于皱叶类型。上述研究结果与观赏羽衣甘蓝田间抗寒表现一致。低温处理下渗透调节物质含量和抗氧化酶活性响应特性表明,不同指标呈现不同的变化趋势,除了可溶性糖在-10℃含量最高外,可溶性蛋白和游离脯氨酸含量,以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性均在-5℃或-8℃达到最大值,并随温度进一步降低而下降。主成分分析结果表明半致死温度、可溶性糖和游离脯氨酸含量是导致羽衣甘蓝抗寒性差异的主要因素。研究结果为建立羽衣甘蓝抗寒性评价体系,进一步解析抗冻机理,培育抗寒新品种奠定理论基础。

农杆菌介导羽衣甘蓝转化体系的建立

以羽衣甘蓝皱白1带柄子叶为外植体,通过农杆菌介导法,研究影响羽衣甘蓝转化的若干因素,建立稳定的遗传转化体系.结果表明,外植体通过2d的预培养,OD600值为0.3的菌液浓度,侵染时间5min,2d的共培养,延迟筛选3d有利于获得较高的转化效率.PCR检测表明,外源基因已整合到羽衣甘蓝基因组中.

甘蓝根寄生线虫新种－芸苔潜根线虫

采自甘蓝根寄生线虫新种──芸苔潜根线虫（ＨｉｒｓｃｈｍａｎｎｉｅｌｌａｂｒａｓｓｉｃａｅＤｕａｎｅｔＬｉｕｎ．ｓｐ．），其鉴定特征为：（１）唇区连续，前端平；（２）口针基球圆形，前端不向后倾斜；（３）半月体和排泄孔相距３－４条体环；（４）阴道弯曲，内部具阴门唇；（５）授精囊球形；（６）雌虫尾端钝圆，尾尖突１－２个，位于尾的中部或近中部；（７）雄虫尾端截形，背面长于腹面。隐稻潜根线虫Ｈ．ａｎｃｈｏｒｙｚａｅ是本种线虫的近缘种，但前者唇拐角呈角状尖锐，口针基球前端向后稍倾斜，授精囊长形袋状，阴道直形，侧尾腺孔和尾端之间具２４－２７条体环，雌雄尾端均为尖形，而本种线虫后拐角钝圆，口针基球前端不向后倾斜，授精囊为圆形，阴道弯曲，侧尾腺孔和尾端之间具１４－１６条体环，雄虫尾端为截形。

甘蓝2号染色体的高分辨率5S rDNA荧光原位杂交

【目的】羽衣甘蓝5SrDNA的染色体定位和拷贝数分析,为进一步利用FISH进行2号染色体基因定位和细胞遗传图谱构建奠定基础。【方法】以羽衣甘蓝为材料,采用荧光原位杂交技术将DIG标记的5SrDNA探针定位于不同分辨率的绒毡层细胞中期染色体、粗线期染色体以及伸长DNA纤维上。【结果】在中期染色体和粗线期染色体上,都同时获得3个杂交信号位点(a、b、c),且位于2号染色体的长臂近着丝粒区域,其信号强度为b>a>c;而在伸长DNA纤维上,出现了3种不同长度的念珠状长链(a、b、c),其物理大小分别为257、359和134kb,这3种长链分别与3个信号位点形成一一对应关系。【结论】在羽衣甘蓝2号染色体上存在3个串联重复位点,粗略估算出3个5SrDNA位点的拷贝数分别为510、712和266。

拟南芥P5CS1基因转化羽衣甘蓝增强耐盐性分析

【目的】分析转拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因羽衣甘蓝的耐盐性,为获得较强的耐盐性羽衣甘蓝品种及其抗逆育种提供理论依据。【方法】将拟南芥P5CS1基因(AtP5CS1)经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植物中,在盐胁迫下,分别检测转基因植株与野生型植株的AtP5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、株系根系性状、整株干质量和鲜质量、叶片相对水含量、叶片电导率和整株存活率。【结果】在150 mmol/L NaCl胁迫下,转基因植株的P5CS1基因mRNA可正常表达,与对照相比,转基因株系Y1、Y2的主根和最长侧根长度较长,侧根数目较多,整株干质量和鲜质量较重;而且相对水含量显著高于对照植株(P<0.05,下同),脯氨酸含量及存活率均极显著高于对照植株(P<0.01),叶片相对电导率显著低于对照植株。【结论】转AtP5CS1基因植株的耐盐表型优于对照,即AtP5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性。

羽衣甘蓝SSR反应体系的优化

为优化羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)SSR反应体系,并利用优化的体系进行引物的筛选。采用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平,并采用L16(45)正交设计进行试验优化,建立了羽衣甘蓝SSR-PCR最佳反应体系。结果表明,各因素不同水平浓度对扩增结果均有一定影响,羽衣甘蓝基因组DNA的最佳SSR反应体系为DNA模板量(50 ng/μL)1.0μL,10×PCR Buffer 1.0μL,引物量(2.0μmol/L)上下游各3.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)0.8μL,Taq聚合酶(5 U/μL)0.2μL,ddH2O 1.0μL,总体积10μL。检测了优化体系的稳定性,利用优化的反应体系对芸薹属植物20对SSR引物进行扩增并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,在所选用的20对引物中,18对扩增出了清晰的条带,11对具有特异扩增条带,多态性引物比率为61%,验证了该体系可用于羽衣甘蓝SSR-PCR扩增和SSR引物的筛选。